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    紫云英根瘤菌不同菌株間結(jié)瘤競爭能力的比較

    2015-01-15 20:51:22鄭會明翟娜娜毛怡玲鐘增濤
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:結(jié)瘤根瘤根瘤菌

    鄭會明+翟娜娜+毛怡玲+鐘增濤

    摘要:通過競爭結(jié)瘤試驗(yàn)研究紫云英根瘤菌不同菌株間的競爭結(jié)瘤能力,以紫云英寧波大橋品系為宿主植物,7株分離自不同生境紫云英根部瘤體內(nèi)的菌株與中慢生華癸根瘤菌7653R為研究對象,采用單獨(dú)接種、與7653R菌株1∶1混合接種方式,在30d時(shí)采樣,統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量、不同菌株的占瘤率、定殖能力等。結(jié)果發(fā)現(xiàn),紫云英根瘤菌2號菌株的競爭能力與7653R相當(dāng),其他菌株的競爭性都不同程度地弱于7653R,尤其是1號菌株的定殖能力最弱,僅是7653R占瘤率的9%。在同時(shí)含有2種根瘤菌的瘤體內(nèi),7653R和競爭菌株的數(shù)量比例相近。不同生境根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力存在差異,試驗(yàn)同時(shí)獲得了1株與經(jīng)典菌株7653R競爭能力相當(dāng)?shù)淖显朴⒏鼍辍?/p>

    關(guān)鍵詞:紫云英根瘤菌;7653R;競爭性;占瘤率

    中圖分類號:S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1002-1302(2014)11-0403-03

    豆科植物的固氮作用是在根瘤菌的參與下完成的,其過程包括根瘤菌吸附侵染豆科植物根毛,引起根毛卷曲形成侵入線,最終引起植物形成根瘤,根瘤菌在根瘤內(nèi)部進(jìn)行生物固氮并將其產(chǎn)物輸送給植物。該共生固氮體系在促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、減少化學(xué)氮肥施用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面都具有極其重要的意義,因而研究、開發(fā)、利用這一共生固氮體系具有重大的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會價(jià)值[1]。大豆、豌豆、苜蓿、三葉草、菜豆等豆科植物可以作為動(dòng)物以及人類的食物氮源;紫云英可作為田間作物的氮肥提高作物產(chǎn)量,也可作為綠肥在貧瘠的土壤中生長,從而提升土壤質(zhì)量。我國已在浙江、福建、江蘇等地廣泛種植紫云英、苜蓿、三葉草等豆科固氮植物,作為綠肥或者牲畜食料。

    實(shí)踐證明,接種與不接種根瘤菌關(guān)系到綠肥植物收獲量的多少,但由于人工接種的根瘤菌劑與土著根瘤菌之間存在競爭性,往往不能達(dá)到預(yù)期的接種效果[2],也阻礙了固氮菌株應(yīng)有效用的發(fā)揮。近年來在競爭結(jié)瘤機(jī)制和根瘤菌寄主特異性方面的研究取得了許多進(jìn)展,對根瘤菌競爭結(jié)瘤相關(guān)基因及豆科植物的寄主專一性結(jié)瘤相關(guān)基因均有了一定的認(rèn)識。其中根瘤菌本身的基因型對競爭結(jié)瘤能力具有重要影響,目前已經(jīng)報(bào)道了根瘤菌的運(yùn)動(dòng)性、趨化性、細(xì)菌素的產(chǎn)生[3]、生長繁殖速度、細(xì)胞表面特征、結(jié)瘤相關(guān)基因[4],如大豆慢生根瘤菌中的nfeC基因[5]、中華苜蓿根瘤菌中的nifA基因等[6],它們在結(jié)瘤競爭力方面發(fā)揮了重要的作用。

    影響競爭結(jié)瘤的因素復(fù)雜多樣,解決方案也很多,但篩選使用競爭結(jié)瘤能力高的根瘤菌和選育抑制土著根瘤菌結(jié)瘤的植物品種是最佳的途徑。陳華癸等最先在我國分離獲得紫云英根部有效結(jié)瘤的菌株中慢生華癸根瘤菌[7],目前在田間試驗(yàn)中被廣泛接種應(yīng)用的是具有良好結(jié)瘤固氮能力的7653R,該菌株同時(shí)還作為中慢生紫云英根瘤菌的典型菌株,其基因組已由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)初步完成測定。本研究從不同生境環(huán)境紫云英的根部瘤體中分離了9株紫云英根瘤菌,比較了其在不同品種紫云英根部結(jié)瘤的能力,同時(shí)還研究了其與典型菌株7653R共同接種時(shí)的競爭結(jié)瘤能力,初步獲得了1株與7653R結(jié)瘤能力相當(dāng)?shù)木?,為后續(xù)大田的接種使用提供了材料,同時(shí)也為后續(xù)研究競爭結(jié)瘤能力相關(guān)的遺傳學(xué)分析提供了新的試驗(yàn)對象。

    1材料與方法

    1.1供試菌株與材料

    試驗(yàn)所用菌株為中慢生華癸根瘤菌7653R,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)。其他9株紫云英根瘤菌分離自不同生境紫云英根部瘤體內(nèi)。根瘤菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為TY培養(yǎng)基[8],所用抗生素濃度為利福平(Rif)20μg/mL、鏈霉素(Str)100μg/mL。

    紫云英種子閩紫5號由福建省土壤肥料所提供,粵肥1號、信陽種、弋江種、寧波大橋和閩紫6號由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;蛭石購自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)芳華園藝中心。

    1.2種子表面消毒與催芽

    將紫云英種子放入無菌三角瓶中,無菌水清洗數(shù)次以洗去種子表面的塵土;75%乙醇處理5min,無菌水洗3次;5%NaClO處理3min,無菌水洗10次以洗凈種子表面殘留試劑;加入適量的無菌水浸泡3h使其充分吸水膨脹,隨后分裝至平板中,使種子單層均勻地鋪開;將種子于22℃黑暗中倒置催芽(在平板蓋底部灑些無菌水以保持濕潤的催芽環(huán)境),約24h后種子露白,即可種植。

    1.3確定紫云英植株品系及菌株

    分別以粵肥1號、信陽種、弋江種、寧波大橋、閩紫6號和閩紫5號共6個(gè)品系紫云英種子作為宿主植物,活化中慢生紫云英根瘤菌菌株至D600nm約為2.0,浸泡已發(fā)芽紫云英種子20min,種植入一次性杯子盛裝的無菌蛭石中,設(shè)置溫室溫度為白天16℃、12h,黑夜22℃、12h,適時(shí)適量澆灌無菌水和無氮營養(yǎng)液。每組種植6盆,每盆5株苗,待第1張真葉長出后,間苗,留下生長狀態(tài)趨于一致的20株苗;同時(shí)接種無菌水處理作為空白對照。分別在15、30d時(shí)觀察結(jié)瘤情況,以結(jié)瘤情況確定競爭結(jié)瘤試驗(yàn)的供試菌株和紫云英種子品系。

    1.4競爭結(jié)瘤試驗(yàn)

    TY培養(yǎng)基中活化根瘤菌細(xì)胞密度至D600nm約2.0,將7653RStr抗性突變株菌液與其他根瘤菌Rif抗性突變株培養(yǎng)菌液等體積(4mL∶4mL)混合,振蕩混勻,浸泡紫云英種子20min,種植,以單獨(dú)接種處理組作為對照;以接種無菌水處理作為空白對照。每組處理設(shè)置20株紫云英重復(fù)。

    1.5根瘤數(shù)量、根瘤重量統(tǒng)計(jì)及菌體分離

    小心拆盆,輕輕抖落根部蛭石,剪取每顆根瘤,記錄瘤數(shù)、瘤質(zhì)量。將單個(gè)根瘤瘤體置于1.6%NaClO下處理1min進(jìn)行表面消毒殺菌,水洗4次,去除殘留藥物。將表面消毒后的單個(gè)根瘤置于1.5mL離心管中,搗碎后用500μL無菌水懸浮,振蕩混勻后,取100μL該菌液到900μL無菌水中,依次進(jìn)行梯度稀釋至10-4。對于單獨(dú)接種根瘤菌的紫云英植株,每個(gè)梯度各取10μL點(diǎn)樣于TY空白板,待長出單菌落后,計(jì)數(shù);對于混合接種根瘤菌的紫云英植株根瘤,每個(gè)梯度各取10μL點(diǎn)樣于分別含有Str100μg/mL、Rif20μg/mL的TY平板上,待長出單菌落后,計(jì)數(shù)。endprint

    2結(jié)果與分析

    2.1確定紫云英植物品系及根瘤菌菌株種類

    從不同生境紫云英根部瘤體分離到了9株根瘤菌,分別單獨(dú)接種至6個(gè)品系的紫云英種子,在15、30d時(shí)觀察結(jié)瘤情況,以7653R菌株作為陽性對照菌。如表1所示,從根瘤菌結(jié)瘤專一性看,8、9號菌株與紫云英共生結(jié)瘤的專一性很強(qiáng),在15d時(shí)只與信陽種共生結(jié)瘤;而1~7號菌株對宿主的專一性較低。從紫云英植物宿主的專一性看,信陽種、弋江種和寧波大橋種對菌種的專一性較其他品系要低:15d時(shí),信陽種可以與所有測試菌株共生結(jié)瘤;30d時(shí),弋江種、寧波大橋種均能和所有菌株共生結(jié)瘤。

    2.2紫云英根瘤菌分離菌株與其Rif抗性菌株結(jié)瘤能力的鑒定

    在以上結(jié)瘤試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用可以與所有測試菌株有效結(jié)瘤的寧波大橋種作為后續(xù)紫云英根瘤菌競爭結(jié)瘤試驗(yàn)的宿主植物,1~7號菌株作為根瘤菌侵染對象。為了區(qū)分瘤體內(nèi)紫云英根瘤菌的種類,需要選擇合適的篩選標(biāo)簽,抗生素是被廣泛應(yīng)用的標(biāo)簽之一[9]。本研究篩選獲得了1~7號7株紫云英根瘤菌的Rif自發(fā)突變抗性株Z1-Z7,檢測了Rif抗性的產(chǎn)生是否會影響原有根瘤菌的結(jié)瘤能力。

    分別將野生型菌株與Rif抗性株單獨(dú)接種到紫云英植株,結(jié)果如圖1所示,野生型和Rif抗性突變株根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量均無顯著差異,因此后續(xù)可以用Rif抗性突變株代表野生型菌株進(jìn)行與7653R間的競爭結(jié)瘤試驗(yàn)。

    [FK(W20][TPDHM1.tif][FK)]

    2.3紫云英分離菌株與7653R間的競爭結(jié)瘤

    在實(shí)踐中接種根瘤菌劑到土壤中時(shí),根瘤菌劑與土著菌的濃度未知、二者之間的數(shù)量比值也不確定。在本競爭結(jié)瘤試驗(yàn)中,設(shè)置了2種接種液濃度,為了更接近于實(shí)際菌劑接種中的細(xì)胞密度,分別設(shè)置了1.0×106CFU/mL和1.0×107CFU/mL2種接種液濃度,浸泡已輕微發(fā)芽的紫云英種子,各20個(gè)重復(fù)。

    在接種后30d時(shí),統(tǒng)計(jì)各處理的根瘤菌總數(shù)和結(jié)瘤數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在結(jié)瘤數(shù)量上,1、2、5、7號菌株與7653R混合接種處理后,根瘤數(shù)量比單獨(dú)接種處理組時(shí)稍少(圖2),3號菌株與7653R混合接種后結(jié)瘤數(shù)量比單獨(dú)接種時(shí)稍多。在瘤體質(zhì)量上,僅4號菌株混合接種的瘤體質(zhì)量低于單獨(dú)接種菌株。這說明菌種之間的競爭可能會影響植株的結(jié)瘤情況,但影響都不顯著。

    在2種不同根瘤菌共同接種過程中,競爭性結(jié)瘤主要是通過比較瘤體內(nèi)根瘤菌的數(shù)量比率,即占瘤率來衡量的[10]。將7653R和1~7號菌株分別1∶1混合接種至紫云英根部,30d后,統(tǒng)計(jì)每處理中根瘤菌的占瘤率情況。如圖3所示,在所有類型的混合接種處理中,86.96%~94.29%的瘤體都是單個(gè)根瘤菌侵染形成,而2種不同根瘤菌共同侵占同一瘤體的比率只有5.71%~13.04%,該結(jié)果與Gage等的研究結(jié)果

    一致[11]。在所有的共同接種試驗(yàn)中,多數(shù)菌株(1、3、4、5、6、7號菌株)的競爭性都不同程度地弱于7653R,占瘤率僅是7653R的43%~62%,尤其是1號菌株的定殖能力最弱,約是7653R占瘤率的9%。該結(jié)果顯示出了傳統(tǒng)大田應(yīng)用菌株7653R良好的競爭能力,但同時(shí)也表明,2號菌株在瘤體中的占瘤率為48.77%,與7653R的競爭能力相當(dāng)(42.44%),這顯示了不同紫云英根瘤菌競爭能力的差異。

    根瘤菌競爭能力的比例還可以通過考察2種根瘤菌共同占據(jù)的瘤體內(nèi)根瘤菌的數(shù)量比例。將圖3中2種根瘤菌共同占據(jù)的瘤體搗碎后,進(jìn)行梯度稀釋計(jì)數(shù),據(jù)抗性計(jì)算其中2種不同根瘤菌確切的細(xì)菌數(shù)量,計(jì)算數(shù)量比值。如圖4所示,在7653R與紫云英分離菌株共同占據(jù)的瘤體內(nèi),7653R與不同根瘤菌的數(shù)量比均接近1,其數(shù)量相當(dāng)。

    3討論

    將紫云英根瘤菌經(jīng)典菌株7653R與分離自不同生境的9株紫云英根瘤菌菌株,分別單獨(dú)接種于閩紫1號、閩紫6號、粵肥2號、弋江種、信陽種、閩紫5號、寧波大橋共6個(gè)品系的紫云英植株,確定結(jié)瘤專一性較低的7株紫云英根瘤菌和寧波大橋種子作為后續(xù)競爭試驗(yàn)的研究菌株。

    在7653R和1~7號菌株間進(jìn)行競爭結(jié)瘤,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單接處理組之間、混接處理組之間在根瘤數(shù)量、根瘤質(zhì)量、結(jié)瘤時(shí)間方面均無顯著差異。在統(tǒng)計(jì)了不同根瘤菌的占瘤率后,確定了2號菌株競爭性較強(qiáng),與7653R占瘤率相當(dāng),其他檢測菌株則都低于7653R,尤其是1號菌株,其占瘤率僅是同時(shí)接種的7653R占瘤率的9%。在同時(shí)含有2種根瘤菌的根瘤內(nèi),7653R和混合接種的紫云英根瘤菌菌數(shù)比值多在0.1~10,且多集中在1附近,說明二者在同一根瘤內(nèi)部的定殖能力相近。

    根瘤菌與植物的共生固氮是二者之間不斷發(fā)生信號交流互作的過程,該過程還包括不同根瘤菌之間的競爭,人工接種的根瘤菌菌劑要取得良好的施肥效果,首先需要具有一定的與土壤中原有根瘤菌競爭的能力。已有的研究結(jié)果表明,影響根瘤菌競爭結(jié)瘤的因素主要是根瘤菌與宿主植物的遺傳因素,也和土壤的生態(tài)環(huán)境相關(guān)。將同一種根瘤菌接種到不同基因型的植株結(jié)瘤,其結(jié)瘤能力表現(xiàn)不同,即根瘤菌對宿主植物基因型有一定的依賴性,如有研究表明大豆的隱性基因rjl能抑制許多大豆慢生根瘤菌的結(jié)瘤[12]。根瘤菌本身基因型對競爭結(jié)瘤能力也有重要影響,一些根瘤菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可抑制其他對該細(xì)菌素敏感的根瘤菌,如可以產(chǎn)生三葉草素的豌豆根瘤菌三葉草型T24菌株,可抑制對三葉草素敏感的菌株的結(jié)瘤,但三葉草素抗性菌株的結(jié)瘤則不受其抑制。田間試驗(yàn)也證實(shí),產(chǎn)生三葉草素的工程菌株比不產(chǎn)三葉草素菌株在占瘤率方面至少高20%,且在產(chǎn)量方面,也不遜于接種不產(chǎn)三葉草素的作物[3]。

    本試驗(yàn)結(jié)果對菌劑接種有一定的理論指導(dǎo)意義。將競爭能力與7653R相當(dāng)?shù)?號菌株制成菌劑可以接種到紫云英根部,最大限度地排斥土著根瘤菌,增強(qiáng)接種效果,以充分發(fā)揮生物固氮的作用,減少化肥的施用。在后續(xù)研究中,還可以將根瘤菌接種于不同品系的紫云英,考察不同的根瘤菌與何種品系紫云英植株共生結(jié)瘤能力最強(qiáng),從而有針對性地進(jìn)行根瘤菌菌劑的定向接種,提高接種效率,用最低的成本改善土壤環(huán)境或得到更多的鮮草量。endprint

    參考文獻(xiàn):

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