洛陽地區(qū)番茄黃化曲葉病的病原鑒定及防治策略

黃獅+糾敏+汪倫記+尤曉顏+李萌+王浩權(quán)

摘要：番茄黃化曲葉?。╰omatoyellowleafcurldisease，TYLCD）在洛陽地區(qū)普遍發(fā)生，但其病原尚不清楚。利用雙生病毒簡并引物PA/PB及番茄黃化曲葉病毒（tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）的特異性引物對表現(xiàn)黃化及曲葉癥狀的疑似樣品進(jìn)行PCR分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TYLCV是引起洛陽地區(qū)大田番茄黃化曲葉病的病原。此外，對番茄黃化曲葉病病原類型及可能的來源途徑進(jìn)行了探討，旨在提出相應(yīng)的預(yù)防措施及防治策略。

關(guān)鍵詞：番茄黃化曲葉??；番茄黃化曲葉病毒；防治策略

中圖分類號：S436.412.1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0153-03

番茄黃化曲葉病（tomatoyellowleafcurldisease，TYLCD）是番茄最為嚴(yán)重的病害之一，具有暴發(fā)突然、擴(kuò)展迅速、危害性強(qiáng)、治療難度大的特點(diǎn)，是一種毀滅性的番茄病害[1-4]。近年來，該病在我國由南向北迅速擴(kuò)張，危害逐年加劇，造成番茄大面積減產(chǎn)甚至毀滅性災(zāi)害[5]。該病的典型癥狀為葉片變小黃化、卷曲、邊緣亮黃色，節(jié)間縮短，植株矮化，花朵減少，開花延遲，坐果少而小，成熟期果實(shí)轉(zhuǎn)色不正常，且果實(shí)成熟不均勻[6]。TYLCD的病原十分復(fù)雜，已報道可侵染番茄的雙生病毒全世界至少有57種，其中在中國有番茄黃化曲葉病毒、中國番茄黃化曲葉病毒、臺灣番茄曲葉病毒、中國番木瓜曲葉病毒、煙草曲莖病毒和泰國番茄黃化曲葉病毒等多種雙生病毒可侵染番茄引起黃化和曲葉癥狀[5]。

自2009年以來，TYLCD在河南洛陽番茄種植區(qū)普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重，一些番茄種植戶由于TYLCD的大面積暴發(fā)，已出現(xiàn)連續(xù)多年不敢種植番茄的現(xiàn)象，而引起洛陽地區(qū)番茄黃化曲葉病的病原株系、基因組變異及可能來源情況還未見報道。本研究于2013年7—8月間，調(diào)查了洛陽地區(qū)大田番茄種植區(qū)TYLCD的發(fā)病情況，并采集了具有黃化、曲葉等典型癥狀的番茄病樣，進(jìn)行病毒病原分子檢測。本研究旨在明確引起洛陽地區(qū)TYLCD的病原種類及其進(jìn)化起源，以針對性地提出防控該病害的相應(yīng)策略。

1材料與方法

1.1發(fā)病情況調(diào)查與樣品采集

2013年7—8月間在洛陽市宜陽縣、孟津縣、偃師市、洛龍區(qū)及瀍河區(qū)主要番茄種植區(qū)進(jìn)行TYLCD發(fā)病情況調(diào)查，并采集表現(xiàn)典型植株矮縮、頂葉卷曲黃化的番茄植株葉片和疑似植株葉片，整理后放于4℃冰箱備用。

1.2病原分子檢測

1.2.1葉片總DNA提取

葉片總DNA的提取參考劉玉樂等的方法[7]，即稱取10mg新鮮番茄病葉，加100μL0.5mol/LNaOH，勻漿后低速離心，上清液用0.1mol/LTris-HCl（pH值8.0）稀釋100倍，取1μL作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2PCR擴(kuò)增、克隆和序列測定

根據(jù)謝艷等[8]報道的檢測粉虱傳雙生病毒的簡并引物PA/PB進(jìn)行PCR，擴(kuò)增雙生病毒基因間隔區(qū)和部分外殼蛋白基因約500bp的特異片段，并進(jìn)行克隆和序列測定。在對測序結(jié)果分析基礎(chǔ)上，利用DNAMAN軟件設(shè)計擴(kuò)增病毒DNA-A近全長序列的特異性引物HN-F/HN-R，擴(kuò)增長度2500bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用AxyPrep凝膠回收試劑盒回收純化，克隆到pMD18-T載體（TaKaRa）上，送到南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。利用DNAMAN軟件（DNAMAN6.0）拼接DNA-A全基因組序列。TYLCV特異性片段擴(kuò)增所用引物及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[9]，所用引物由上海Sangon生物工程有限公司合成（表1）。

1.2.3DNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA序列用DNAMANVersion6.0進(jìn)行處理和分析。序列比對采用NCBI序列比對工具BLAST程序nucleotideblast，多序列比較分析采用ClustalW，進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA4.02的鄰近相鄰法（Neighbor-joining）。

2結(jié)果與分析

2.1大田番茄TYLCD發(fā)病情況

2013年7—8月間，在洛陽市宜陽縣、孟津縣、偃師市、洛龍區(qū)及瀍河區(qū)主要番茄種植區(qū)TYLCD發(fā)病情況的調(diào)查，病株率一般為20%～30%，嚴(yán)重的高達(dá)60%～70%，有些零星種植區(qū)發(fā)病率甚至為100%。

2.2病原檢測結(jié)果

以提取的番茄樣品總DNA為模板，利用雙生病毒簡并引物PA/PB對采集的27份番茄樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果在18份樣品中擴(kuò)增得到約500bp的特異性片段，陽性檢出率為66.7%（表2）。將18份檢測陽性樣品進(jìn)行DNA-A部分片段克隆、序列測定及分析，發(fā)現(xiàn)18份分離物之間DNA部分序列同源性高達(dá)98.5%以上。由此可見，檢測的18份分離物很可能是由同一種病毒引起的。另外，利用TYLCV的特異性引物對27份番茄樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果從25份樣品中擴(kuò)增到約400bp的特異性片段（表2）。

2.3DNA-A全序列特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

選擇番茄HNLL1樣品進(jìn)行DNA-A全基因組擴(kuò)增及克隆測序，結(jié)果表明DNA-A序列全長為2781nts，具有典型的雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征，編碼6個ORFs。其中病毒鏈編碼2個ORFs，即AV1（308～1084nt，編碼CP）和AV2（148～498nt，編碼與病毒移動相關(guān)基因）；互補(bǔ)鏈編碼4個ORFs，分別為AC1（1542～2615nt，編碼復(fù)制酶）、AC2（1226～1633nt，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白）、AC3（1081～1485nt，編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白）和AC4（2171～2464nt，編碼復(fù)制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）。在基因AC1與AV2之間有313nt的基因間隔區(qū)（intergenicregion，IR），該區(qū)含有保守序列TAATATTAC、TATAbox、正向重復(fù)序列GGTGTCT。

將HNLL1分離物DNA-A全序列與NCBI上登錄的中國各地TYLCV不同株系代表分離物進(jìn)行同源比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNLL1分離物與已報道的番茄黃化曲葉病毒北京分離物（JF414236.1）的核苷酸序列相似度最高，為99.6%。聚類分析表明，該分離物（TYLCV-HNLL1）與我國已報道的TYLCV各分離物同源關(guān)系較近，且與TYLCV-BJ3分離物親緣關(guān)系最近（圖1）。

3小結(jié)與討論

3.1病原種類及來源

本研究利用雙生病毒簡并引物PA/PB對采集的27份樣品進(jìn)行PCR檢測，其中從18份樣品中擴(kuò)增得到約500bp特異性片段，陽性檢出率為66.7%（表2），其原因可能是由于簡并引物PA/PB本身的局限性所致。為此，在本試驗(yàn)中進(jìn)一步利用TYLCV的特異性引物對27份番茄樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果從25份樣品中擴(kuò)增到約400bp的特異性片段（表2），上述結(jié)果表明，TYLCV是引起洛陽大田番茄TYLCD的病源，這是首次在分子水平上驗(yàn)證洛陽地區(qū)番茄黃化曲葉病由TYLCV引起。

TYLCVDNA-A全基因序列構(gòu)建的HNLL1分離物與中國其他地區(qū)報道的TYLCV分離物的進(jìn)化樹比對結(jié)果表明，TYLCV-HNLL1分離物與北京分離物TYLCV-BJ3親緣關(guān)系最近，聚為一分支，但二者的地理位置相差較遠(yuǎn)。由此說明，河南洛陽地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒可能是通過人為的貿(mào)易活動，攜帶了染有該病毒的番茄種苗或介體由北京傳入。

3.2防治策略

3.2.1嚴(yán)控傳毒媒介——煙粉虱

TYLCV為粉虱傳雙生病毒（whitfly-transmittedgeminivirus，WTG），煙粉虱是其唯一的傳播媒介，一旦攜毒，即可終生帶毒和傳毒。單頭帶毒煙粉虱成蟲即可成功地將TYLCV傳播于健康植株上，尤其在幼苗期傳毒成功率更高，且傳毒效率隨著帶毒煙粉虱數(shù)量的增多而升高[10]。近兩年，煙粉虱在洛陽地區(qū)大面積發(fā)生，且生物型主要是外來入侵的Q型和B型，本地種群幾乎被入侵型所替代（本實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果）。因此，有效防治TYLCV的傳播媒介-煙粉虱是防控TYLCV在該地區(qū)大發(fā)生及快速擴(kuò)散的關(guān)鍵措施之一。

有關(guān)煙粉虱的防治措施已經(jīng)有很多報道，主要包括物理防治（黃板誘殺、防蟲網(wǎng)隔離等）、農(nóng)業(yè)防治（防控越冬蟲源等）及化學(xué)防治（化學(xué)藥劑的噴施）等[6，11-17]。然而，由于煙粉虱個體較小，其卵及1齡幼蟲用肉眼觀察不到，致使部分番茄種植戶在一定程度上忽視了煙粉虱的危害性，以至于將帶蟲苗或帶毒的番茄種苗視為無蟲、無毒種苗進(jìn)行栽植。此外，TYLCV在侵染植物之后到出現(xiàn)病毒癥狀需要一定時間，雖未出現(xiàn)發(fā)病癥狀或癥狀不明顯但其已經(jīng)帶毒，毒株上羽化的煙粉虱已是帶毒個體，可快速地將攜帶的病毒傳播于其他植株上，這些因素都是導(dǎo)致后期TYLCV快速傳播的重要原因。嚴(yán)控蟲苗及毒苗的存在是防治TYLCD后期大發(fā)生的關(guān)鍵因子。

3.2.2防控毒源的異地傳播

人類的貿(mào)易活動也是TYLCV快速異地傳播的重要途徑。已有研究表明，中國番木瓜曲葉病毒（papayaleafcurlChinavirus，PaLCuCNV）主要在廣西省發(fā)生，但2009年在河南省中牟縣番茄種植區(qū)也檢測到該病毒病的發(fā)生[18]，而與廣西相鄰的湖南省并未發(fā)現(xiàn)該病毒病的發(fā)生。PaLCuCNV由廣西經(jīng)湖南省、湖北省成功傳播至河南省，其主要原因可能是由于人為的貿(mào)易活動攜帶了染有病毒的番茄種苗或介體造成的。隨著人類貿(mào)易往來的日益頻繁，不同WTG異地傳播的概率也隨之增高。因此，對貿(mào)易往來過程中的苗木一定要進(jìn)行檢疫，嚴(yán)控有蟲苗、毒苗的跨地區(qū)運(yùn)輸也是防控TYLCV快速傳播的重要措施之一。

近幾年，番茄黃化曲葉病在河南洛陽地區(qū)相繼暴發(fā)，特別是秋延后番茄，給番茄生產(chǎn)造成了巨大的損失。鑒于此類病毒擴(kuò)散蔓延非常迅速，危害異常嚴(yán)重，生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注其發(fā)生危害情況，及時發(fā)現(xiàn)，盡早進(jìn)行防治。

參考文獻(xiàn)：

[1]邢衛(wèi)鋒，丁雪玲，柯紅嬌，等.番茄黃化曲葉病毒病生防菌的篩選及防治效果研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：110-112.

[2]孟夏麗，史亮.預(yù)防番茄黃化曲葉病毒的關(guān)鍵措施[J].中國果菜，2013（3）：32-33.[HJ1.8mm]

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[14]楊代鳳，周奮啟，顧俊榮，等.5種藥劑對煙粉虱的室內(nèi)毒力及田間防效[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：114-115.

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將HNLL1分離物DNA-A全序列與NCBI上登錄的中國各地TYLCV不同株系代表分離物進(jìn)行同源比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNLL1分離物與已報道的番茄黃化曲葉病毒北京分離物（JF414236.1）的核苷酸序列相似度最高，為99.6%。聚類分析表明，該分離物（TYLCV-HNLL1）與我國已報道的TYLCV各分離物同源關(guān)系較近，且與TYLCV-BJ3分離物親緣關(guān)系最近（圖1）。

3小結(jié)與討論

3.1病原種類及來源

本研究利用雙生病毒簡并引物PA/PB對采集的27份樣品進(jìn)行PCR檢測，其中從18份樣品中擴(kuò)增得到約500bp特異性片段，陽性檢出率為66.7%（表2），其原因可能是由于簡并引物PA/PB本身的局限性所致。為此，在本試驗(yàn)中進(jìn)一步利用TYLCV的特異性引物對27份番茄樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果從25份樣品中擴(kuò)增到約400bp的特異性片段（表2），上述結(jié)果表明，TYLCV是引起洛陽大田番茄TYLCD的病源，這是首次在分子水平上驗(yàn)證洛陽地區(qū)番茄黃化曲葉病由TYLCV引起。

TYLCVDNA-A全基因序列構(gòu)建的HNLL1分離物與中國其他地區(qū)報道的TYLCV分離物的進(jìn)化樹比對結(jié)果表明，TYLCV-HNLL1分離物與北京分離物TYLCV-BJ3親緣關(guān)系最近，聚為一分支，但二者的地理位置相差較遠(yuǎn)。由此說明，河南洛陽地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒可能是通過人為的貿(mào)易活動，攜帶了染有該病毒的番茄種苗或介體由北京傳入。

3.2防治策略

3.2.1嚴(yán)控傳毒媒介——煙粉虱

TYLCV為粉虱傳雙生病毒（whitfly-transmittedgeminivirus，WTG），煙粉虱是其唯一的傳播媒介，一旦攜毒，即可終生帶毒和傳毒。單頭帶毒煙粉虱成蟲即可成功地將TYLCV傳播于健康植株上，尤其在幼苗期傳毒成功率更高，且傳毒效率隨著帶毒煙粉虱數(shù)量的增多而升高[10]。近兩年，煙粉虱在洛陽地區(qū)大面積發(fā)生，且生物型主要是外來入侵的Q型和B型，本地種群幾乎被入侵型所替代（本實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果）。因此，有效防治TYLCV的傳播媒介-煙粉虱是防控TYLCV在該地區(qū)大發(fā)生及快速擴(kuò)散的關(guān)鍵措施之一。

有關(guān)煙粉虱的防治措施已經(jīng)有很多報道，主要包括物理防治（黃板誘殺、防蟲網(wǎng)隔離等）、農(nóng)業(yè)防治（防控越冬蟲源等）及化學(xué)防治（化學(xué)藥劑的噴施）等[6，11-17]。然而，由于煙粉虱個體較小，其卵及1齡幼蟲用肉眼觀察不到，致使部分番茄種植戶在一定程度上忽視了煙粉虱的危害性，以至于將帶蟲苗或帶毒的番茄種苗視為無蟲、無毒種苗進(jìn)行栽植。此外，TYLCV在侵染植物之后到出現(xiàn)病毒癥狀需要一定時間，雖未出現(xiàn)發(fā)病癥狀或癥狀不明顯但其已經(jīng)帶毒，毒株上羽化的煙粉虱已是帶毒個體，可快速地將攜帶的病毒傳播于其他植株上，這些因素都是導(dǎo)致后期TYLCV快速傳播的重要原因。嚴(yán)控蟲苗及毒苗的存在是防治TYLCD后期大發(fā)生的關(guān)鍵因子。

3.2.2防控毒源的異地傳播

人類的貿(mào)易活動也是TYLCV快速異地傳播的重要途徑。已有研究表明，中國番木瓜曲葉病毒（papayaleafcurlChinavirus，PaLCuCNV）主要在廣西省發(fā)生，但2009年在河南省中牟縣番茄種植區(qū)也檢測到該病毒病的發(fā)生[18]，而與廣西相鄰的湖南省并未發(fā)現(xiàn)該病毒病的發(fā)生。PaLCuCNV由廣西經(jīng)湖南省、湖北省成功傳播至河南省，其主要原因可能是由于人為的貿(mào)易活動攜帶了染有病毒的番茄種苗或介體造成的。隨著人類貿(mào)易往來的日益頻繁，不同WTG異地傳播的概率也隨之增高。因此，對貿(mào)易往來過程中的苗木一定要進(jìn)行檢疫，嚴(yán)控有蟲苗、毒苗的跨地區(qū)運(yùn)輸也是防控TYLCV快速傳播的重要措施之一。

近幾年，番茄黃化曲葉病在河南洛陽地區(qū)相繼暴發(fā)，特別是秋延后番茄，給番茄生產(chǎn)造成了巨大的損失。鑒于此類病毒擴(kuò)散蔓延非常迅速，危害異常嚴(yán)重，生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注其發(fā)生危害情況，及時發(fā)現(xiàn)，盡早進(jìn)行防治。

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將HNLL1分離物DNA-A全序列與NCBI上登錄的中國各地TYLCV不同株系代表分離物進(jìn)行同源比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNLL1分離物與已報道的番茄黃化曲葉病毒北京分離物（JF414236.1）的核苷酸序列相似度最高，為99.6%。聚類分析表明，該分離物（TYLCV-HNLL1）與我國已報道的TYLCV各分離物同源關(guān)系較近，且與TYLCV-BJ3分離物親緣關(guān)系最近（圖1）。

3小結(jié)與討論

3.1病原種類及來源

本研究利用雙生病毒簡并引物PA/PB對采集的27份樣品進(jìn)行PCR檢測，其中從18份樣品中擴(kuò)增得到約500bp特異性片段，陽性檢出率為66.7%（表2），其原因可能是由于簡并引物PA/PB本身的局限性所致。為此，在本試驗(yàn)中進(jìn)一步利用TYLCV的特異性引物對27份番茄樣品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果從25份樣品中擴(kuò)增到約400bp的特異性片段（表2），上述結(jié)果表明，TYLCV是引起洛陽大田番茄TYLCD的病源，這是首次在分子水平上驗(yàn)證洛陽地區(qū)番茄黃化曲葉病由TYLCV引起。

TYLCVDNA-A全基因序列構(gòu)建的HNLL1分離物與中國其他地區(qū)報道的TYLCV分離物的進(jìn)化樹比對結(jié)果表明，TYLCV-HNLL1分離物與北京分離物TYLCV-BJ3親緣關(guān)系最近，聚為一分支，但二者的地理位置相差較遠(yuǎn)。由此說明，河南洛陽地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒可能是通過人為的貿(mào)易活動，攜帶了染有該病毒的番茄種苗或介體由北京傳入。

3.2防治策略

3.2.1嚴(yán)控傳毒媒介——煙粉虱

TYLCV為粉虱傳雙生病毒（whitfly-transmittedgeminivirus，WTG），煙粉虱是其唯一的傳播媒介，一旦攜毒，即可終生帶毒和傳毒。單頭帶毒煙粉虱成蟲即可成功地將TYLCV傳播于健康植株上，尤其在幼苗期傳毒成功率更高，且傳毒效率隨著帶毒煙粉虱數(shù)量的增多而升高[10]。近兩年，煙粉虱在洛陽地區(qū)大面積發(fā)生，且生物型主要是外來入侵的Q型和B型，本地種群幾乎被入侵型所替代（本實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果）。因此，有效防治TYLCV的傳播媒介-煙粉虱是防控TYLCV在該地區(qū)大發(fā)生及快速擴(kuò)散的關(guān)鍵措施之一。

有關(guān)煙粉虱的防治措施已經(jīng)有很多報道，主要包括物理防治（黃板誘殺、防蟲網(wǎng)隔離等）、農(nóng)業(yè)防治（防控越冬蟲源等）及化學(xué)防治（化學(xué)藥劑的噴施）等[6，11-17]。然而，由于煙粉虱個體較小，其卵及1齡幼蟲用肉眼觀察不到，致使部分番茄種植戶在一定程度上忽視了煙粉虱的危害性，以至于將帶蟲苗或帶毒的番茄種苗視為無蟲、無毒種苗進(jìn)行栽植。此外，TYLCV在侵染植物之后到出現(xiàn)病毒癥狀需要一定時間，雖未出現(xiàn)發(fā)病癥狀或癥狀不明顯但其已經(jīng)帶毒，毒株上羽化的煙粉虱已是帶毒個體，可快速地將攜帶的病毒傳播于其他植株上，這些因素都是導(dǎo)致后期TYLCV快速傳播的重要原因。嚴(yán)控蟲苗及毒苗的存在是防治TYLCD后期大發(fā)生的關(guān)鍵因子。

3.2.2防控毒源的異地傳播

人類的貿(mào)易活動也是TYLCV快速異地傳播的重要途徑。已有研究表明，中國番木瓜曲葉病毒（papayaleafcurlChinavirus，PaLCuCNV）主要在廣西省發(fā)生，但2009年在河南省中牟縣番茄種植區(qū)也檢測到該病毒病的發(fā)生[18]，而與廣西相鄰的湖南省并未發(fā)現(xiàn)該病毒病的發(fā)生。PaLCuCNV由廣西經(jīng)湖南省、湖北省成功傳播至河南省，其主要原因可能是由于人為的貿(mào)易活動攜帶了染有病毒的番茄種苗或介體造成的。隨著人類貿(mào)易往來的日益頻繁，不同WTG異地傳播的概率也隨之增高。因此，對貿(mào)易往來過程中的苗木一定要進(jìn)行檢疫，嚴(yán)控有蟲苗、毒苗的跨地區(qū)運(yùn)輸也是防控TYLCV快速傳播的重要措施之一。

近幾年，番茄黃化曲葉病在河南洛陽地區(qū)相繼暴發(fā)，特別是秋延后番茄，給番茄生產(chǎn)造成了巨大的損失。鑒于此類病毒擴(kuò)散蔓延非常迅速，危害異常嚴(yán)重，生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注其發(fā)生危害情況，及時發(fā)現(xiàn)，盡早進(jìn)行防治。

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