江蘇省水稻細(xì)菌性基腐病病原分離與抗性資源鑒定

李文奇+王軍+范方軍+朱金燕+王芳權(quán)+楊杰+仲維功

摘要：水稻基腐病是由玉米狄克氏細(xì)菌（Dickeyazeae）侵染引起的毀滅性細(xì)菌病害，對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有潛在的威脅。分別從江蘇省南京市、揚(yáng)州市采集水稻病根，通過菌落形態(tài)特征觀察、分子鑒定以及致病性驗(yàn)證等對致病細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定；同時(shí)篩選可供利用的太湖流域水稻抗性品種。結(jié)果表明：分離到的水稻基腐病致病菌JS2012是玉米狄克氏細(xì)菌；從56份太湖流域水稻資源中共篩選到26份抗性資源，結(jié)果為進(jìn)一步研究水稻細(xì)菌性基腐病以及培育抗病品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；細(xì)菌性基腐??；玉米狄克氏細(xì)菌；太湖流域；水稻抗性品種

中圖分類號：S432.4+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0139-04

近年來，水稻細(xì)菌性基腐病在我國多個(gè)省（區(qū)、市）均有發(fā)生，且有擴(kuò)散蔓延和逐年加重的趨勢，成為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的嚴(yán)重障礙，潛在威脅著我國的糧食安全[1]。培育抗病品種是生產(chǎn)上防治水稻細(xì)菌性基腐病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，因此開展水稻基腐病病原研究以及抗病資源的篩選鑒定是水稻安全生產(chǎn)的迫切需要。

水稻基腐病是由玉米狄克氏菌（Dickeyazeae，別稱Erwiniachrysanthemipv.zeae）引起的細(xì)菌性病害[1]。水稻基腐病的典型癥狀是使植株莖基部和根節(jié)部變?yōu)楹稚蛏詈稚橛袗撼粑?。水稻基腐病在水稻整個(gè)生育期間都可以發(fā)病，主要通過水稻根部和莖基部的傷口侵入[2]。無論是在分蘗期、拔節(jié)期還是在抽穗期，一旦發(fā)病，植株便呈現(xiàn)失水、變黃和青枯癥狀，孕穗期形成白穗[3-5]。從20世紀(jì)80年代初開始，水稻細(xì)菌性基腐病在我國的各個(gè)?。▍^(qū)、市）蔓延[2-3]，特別是1988年在江蘇省沿海的如東縣大面積發(fā)生，有2.67萬hm2粳稻發(fā)病，嚴(yán)重發(fā)病的有1萬hm2左右，由于病株多數(shù)形成枯孕穗或枯白穗，造成直接產(chǎn)量損失在90%左右[6]；此后很長一段時(shí)間內(nèi)，水稻基腐病在各地區(qū)未嚴(yán)重發(fā)生。近年來，在湖北省宜都市和枝江市[7-8]、云南省多個(gè)地區(qū)[9]、湖南省邵東縣等[10]、福建省云和縣[11]、黑龍江省雞西市[12]、海南省[13]等地相繼有水稻細(xì)菌性基腐病發(fā)生。目前該病在江蘇省的危害也有上升的趨勢，如2007年在江蘇省海安縣稻田發(fā)生嚴(yán)重的水稻細(xì)菌性基腐病，平均病田率、枯穗率分別達(dá)到33.66%、0.65%，對水稻產(chǎn)量造成了嚴(yán)重?fù)p失[14]。由于該病癥狀類似螟蟲危害或生理性青枯，易導(dǎo)致該病的診斷失誤，從而延誤該病的發(fā)現(xiàn)時(shí)間，不能及時(shí)通報(bào)，這也是該病目前報(bào)道較少的重要原因之一[15]。

選育抗病品種是防控水稻基腐病的有效途徑。20世紀(jì)80年代，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用病原物浸根接種法對622份水稻品種資源進(jìn)行基腐病抗性鑒定，共篩選出高抗的水稻資源127份，中抗的水稻資源210份，并發(fā)現(xiàn)秈稻品種中存在抗性，而粳稻品種多感病[16-17]。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉瓊光等對來自廣東省各地培育出的共42個(gè)新品種和推廣的栽培品種進(jìn)行了抗病性鑒定[18]。目前，尚不清楚太湖流域水稻品種對基腐病的抗性水平。

本研究針對江蘇省近年來發(fā)生的水稻基腐病進(jìn)行病原分離與鑒定，以期明確致病細(xì)菌，并進(jìn)一步挖掘太湖流域抗基腐病水稻品種資源，從而為防治水稻基腐病提供科學(xué)依據(jù)，并為培育抗病水稻品種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

用于水稻基腐病分離的粳稻品種來自于江蘇省南京市和揚(yáng)州市大田栽培發(fā)病的南粳45，為筆者所在項(xiàng)目組保存；用于抗性資源篩選的試驗(yàn)材料為56份太湖流域水稻地方品種，包括12份秈稻、44份粳稻，為筆者所在項(xiàng)目組保存。

1.2病原菌的分離和鑒定

采用平板劃線分離法[19]進(jìn)行病原細(xì)菌分離。將發(fā)病的水稻莖基部和根用清水洗凈，再用刀片切成約5mm長的病組織，用70%乙醇消毒并用滅菌水沖洗3次后，放在滅菌載玻片上的滅菌水中，用滅菌玻璃棒碾碎。靜置一段時(shí)間后，用滅菌的移植環(huán)蘸取組織液在瓊脂平板上劃線，28℃培養(yǎng)4～5d。挑取單菌落純化培養(yǎng)4～5次，根據(jù)柯赫氏法則，從分離純化的病原菌上挑取單菌落進(jìn)一步培養(yǎng)，采用針刺法回接水稻根系，待出現(xiàn)基腐病典型癥狀后保存菌株。

1.3細(xì)菌基因組提取

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒（OMEGA公司）進(jìn)行細(xì)菌基因組的提取。

1.4基腐病菌特異性基因的PCR擴(kuò)增

從NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢已經(jīng)報(bào)道的水稻細(xì)菌性基腐病菌16SrDNA（JQ284040）序列[20]，設(shè)計(jì)引物16S-up：5′-GATTGAACGCTGGCGGCAGG-3′、16S-down：5′-ATTCCGATTAACGCTTGCAC-3′，以分離菌株的基因組為模板擴(kuò)增16SrDNA序列。根據(jù)已報(bào)道的水稻細(xì)菌性基腐病菌ZJU2012的gyrB、recA、fliC基因分別設(shè)計(jì)引物g-up：5′-CCTCAAGTATCAAGGTATTA-3′、g-down：5′-ATTTCCACGCCGATGTCGTC-3′；r-up：5′-CGCCAGCAGCCTCTTCATTA-3′、r-down：5′-AGATCCGTATGAAGATTGGT-3′；f-up：5′-GAACGATACCAACGGCACTC-3′、f-down：5′-CAGCGATTACTGCAGCAGTT-3′[21]。25μLPCR反應(yīng)體系為：0.5μLDNA模板，各0.5μL上下游引物，2.0μLdNTP混合物，0.125μLTaKaRaTaq，2.5μL10×PCRbuffer，加ddH2O定容至25.0μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4min；95℃變性45s，58℃退火40s；72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；15℃保存。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，對擴(kuò)增片段進(jìn)行回收后送上海英駿生物技術(shù)公司測序。

1.5抗性資源鑒定

針對本試驗(yàn)保存的太湖流域水稻品種資源進(jìn)行基腐病抗性鑒定。按照劉瓊光等的方法[18]，將20d秧齡的56份水稻親本材料傷根后，浸入基腐病菌液（濃度1×108CFU/mL）中3h，然后移栽入土中。每個(gè)材料50株苗，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以液體培養(yǎng)基作為陰性對照。移栽后7～10d開始調(diào)查發(fā)病情況，調(diào)查的分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，無癥狀；1級，心葉枯萎1/3以下；2級，心葉枯萎1/3～1/2（含1/2、1/3）；3級，心葉枯萎1/2～3/4（含1/2）；4級，心葉枯萎3/4及以上?？剐苑旨墭?biāo)準(zhǔn)為：高抗，病情指數(shù)0～5；中抗，病情指數(shù)5.1～12.4；中感，病情指數(shù)12.5～19.9；高感，病情指數(shù)20及以上[18]。

2結(jié)果與分析

2.1病原細(xì)菌的分離與形態(tài)特征

2012年9月至10月期間，在江蘇省南京市、揚(yáng)州市等地發(fā)現(xiàn)多塊稻田發(fā)生白穗、葉片萎蔫以及干枯的現(xiàn)象（圖1-A、1-B），且發(fā)病植株根系變黑腐爛（圖1-C）并伴隨有惡臭味，為水稻細(xì)菌性基腐病的典型致病癥狀。對收集的8份發(fā)病植株進(jìn)行病原分離和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在所有的發(fā)病植株上均分離到同一菌株，命名為JS2012。在牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后，菌落呈乳白色，后逐漸變成淡土黃色，且邊緣不整齊。

2.2病原細(xì)菌的分子鑒定

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的水稻細(xì)菌性基腐病菌的16SrDNA序列設(shè)計(jì)引物，以分離到的水稻細(xì)菌性基腐病菌JS2012的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的16SrDNA序列，得到1條長度約為450bp的片段（圖2-A）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆并送上海英駿生物技術(shù)公司測序，得到JS2012的16SrDNA序列。經(jīng)序列比對和分析，與已報(bào)道的水稻基腐病菌16SrDNA的序列一致性為100%。進(jìn)一步根據(jù)已報(bào)道的水稻基腐病菌ZJU2012基因組中的gyrB、recA、fliC基因序列設(shè)計(jì)引物，對JS2012菌株基因組中的相關(guān)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2-B，經(jīng)測序后與已經(jīng)報(bào)道的水稻基腐病菌ZJU2012序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，JS2012的gyrB、recA、fliC基因序列與ZJU2012的基因序列有100%的一致性。

2.3病原細(xì)菌的致病性測定

根據(jù)細(xì)菌的生長特征和分子鑒定結(jié)果，對初步確認(rèn)為Dickeyazeae的菌株JS2012進(jìn)一步應(yīng)用活體水稻幼苗根部刺傷接種，按照柯赫氏法則進(jìn)行回接驗(yàn)證，測定其致病性。由圖2-C可以看出，接種10d后的水稻幼苗出現(xiàn)水稻細(xì)菌性基腐病的典型癥狀，地上部分葉片（包括心葉）出現(xiàn)萎蔫甚至干枯，地下部分發(fā)病根系變黑腐爛，并伴有強(qiáng)烈的惡臭味，以液體培養(yǎng)基為陰性對照的水稻則沒有出現(xiàn)基腐病癥狀。接著對發(fā)病水稻根系進(jìn)行病原分離與分子鑒定，再次獲得了JS2012菌株。

2.4太湖流域水稻品種抗性資源的鑒定

對56份太湖流域水稻品種資源進(jìn)行的基腐病抗性鑒定結(jié)果表明，這些太湖水稻品種中，有8份品種顯示高抗基腐病，分別是飛來鳳、帽子頭、野鳳凰、鳳凰稻、愛柴白、千山樹、青殼種、早石稻；有12份品種顯示中抗基腐病，分別是鐵殼稻、白殼晚稻、小百野稻、白殼石稻、團(tuán)粒秈、碗兒秈、蘆花白、黑殼蘆花白、長子蘆花白、矮箕殼、小黃早、不留名；另外還有36份感病品種，包括19份中感品種、17份高感品種（圖3、表1）。這些結(jié)果可以初步說明，太湖流域水稻品種中存在可供利用的抗性資源，并且不同秈稻和粳稻品種存在不同的抗性。

3結(jié)論與討論

我國對水稻基腐病的研究報(bào)道始于20世紀(jì)80年代初，分別從浙江省水稻、玉米兩大作物中分離得到基腐病菌菊歐氏桿菌（Erwiniachrysanthemi）[3，15]（現(xiàn)統(tǒng)稱為玉米狄克氏細(xì)菌Dickeyazeae[1]）；此后在很長一段時(shí)間都沒有發(fā)現(xiàn)暴發(fā)。目前，在全國15個(gè)省（區(qū)）均發(fā)現(xiàn)有水稻基腐病發(fā)生，如江蘇省的多個(gè)市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)水稻基腐病[4-14]。水稻基腐病對水稻生產(chǎn)帶來的嚴(yán)重影響日趨明顯，作為具有潛在暴發(fā)可能的細(xì)菌性病害引起了水稻科研工作者高度重視。目前在全國范圍內(nèi)，針對水稻基腐病菌分離鑒定、生長發(fā)育、侵染循環(huán)、致病性以及抗性資源篩選開展了一系列研究[18，22-25]，為預(yù)防水稻基腐病的大面積暴發(fā)流行提供了科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)首次對在江蘇省南京市、揚(yáng)州市分離的水稻細(xì)菌性基腐病進(jìn)行形態(tài)特征、致病性和水稻品種抗性等方面的研究。結(jié)果表明，發(fā)生在江蘇省南京市、揚(yáng)州市的水稻基腐病是由Dickeyazeae引起的，與之前浙江大學(xué)報(bào)道的基腐病菌菌株ZJU2012（2012年分離于廣東省）有較高的一致性，很有可能是同一種病原菌，具體還有待于進(jìn)一步鑒定；另一方面也說明，水稻基腐病作為適應(yīng)性較強(qiáng)的細(xì)菌性病害正在全國水稻產(chǎn)區(qū)范圍內(nèi)擴(kuò)散蔓延，關(guān)于其抗性品種資源篩選和抗性機(jī)制分析等基礎(chǔ)研究工作亟待開展。

培育抗病品種是防治水稻細(xì)菌性基腐病的安全有效且對環(huán)境友好的重要途徑，而篩選抗性品種資源是培育抗病品種的重要前提。王金生等采用浸根接種法對622個(gè)水稻品種進(jìn)行抗病性測定表明，抗病品種占54.2%，感病品種占45.8%，且秈稻較粳稻抗病[17]。劉瓊光等對廣東省各地培育出的共42個(gè)新品種和推廣的栽培品種進(jìn)行了抗病性鑒定[18]。本研究對太湖流域水稻品種進(jìn)行抗基腐病鑒定，結(jié)果表明，粳稻和秈稻中都存在抗性資源，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，粳稻品種抗性差異明顯，如小青芒、晚中秋、摧不倒、黃系光、甩殺極、浦東青、潤葉小青芒、晚中秋、黃系光、桂圓黃、早紅蓮、晚金秈、太湖秈、硬頭頸、光頭蘆花白、矮腳蘆花白、一時(shí)興、香粳糯、晚野稻、潤葉黃、浦東青、甩殺極、摧不倒高感

大稻穗頭、黃谷粳稻、小黃稻、大頭鬼、六十日、杜子秈、尖粒子、流離種、陳家種、長稻頭、矮大頭、矮箕光、長箕光、硬頭尖、荒三石、白殼荒三石、金山晚、拖過山、小紅棗中感

鐵殼稻、白殼晚稻、小百野稻、白殼石稻、團(tuán)粒秈、碗兒秈、蘆花白、黑殼蘆花白、長子蘆花白、矮箕殼、小黃早、不留名中抗飛來鳳、帽子頭、野鳳凰、鳳凰稻、愛柴白、千山樹、青殼種、早石稻高抗黃、晚野稻、香粳糯等發(fā)病率極高，高感基腐??；而帽子頭、飛來鳳、野鳳凰、愛柴白、早石稻、千山樹、青殼稻、鐵殼稻、白殼晚稻、小百野稻、白殼石稻、團(tuán)粒秈、碗兒秈、蘆花白、黑殼蘆花白、長子蘆花白、矮箕殼、小黃早、不留名對基腐病表現(xiàn)出不同程度的抗性；此外，秈稻品種也具有同樣抗性的分化。這說明不同粳稻品種間以及秈粳稻之間抗病性存在較大差異，但都存在抗性基因資源，因此如何科學(xué)合理利用水稻抗基腐病品種是當(dāng)前生產(chǎn)上面臨的問題。

目前，對水稻基腐病的研究還處于起步階段，盡管取得了一定的研究進(jìn)展，但是仍有很多工作要做，包括利用抗性水稻資源來解析水稻與基腐病菌互作響應(yīng)機(jī)制和水稻抗病信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及基腐病菌的侵染和致病機(jī)理等。這些研究可為抗水稻基腐病新品種的培育提供重要的理論依據(jù)和基因資源。

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