不同長春花中3種生物堿的含量測定

詹小寧

【摘 要】 目的：建立快速準(zhǔn)確的長春花內(nèi)生物堿含量測定方法，為尋找高含量品種提供方法和依據(jù)。方法：采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），對收集到的10個長春花品種中的文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿含量進(jìn)行了測定，色譜柱：Dikma Diamonsil-C18 （ 46mm ×250mm， 5μm）；流動相為A∶07%二乙胺（磷酸調(diào)整pH至72）；B：乙腈：甲醇=25：40。A∶B=35∶65；流速1ml/min。柱溫35℃。檢測波長：280nm。結(jié)果：文多靈：Y=200×106X+546×104，r=09999，線性范圍：02～4μg；長春質(zhì)堿：Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍：02～4μg；長春堿：Y=176×106X-717×104，r=09999，線性范圍：02～4μg。文多靈含量最高的是1號品種，長春質(zhì)堿含量最高的是3號品種，長春堿含量最高的是2號品種，三種生物堿總和最高的是3號品種。結(jié)論：該方法簡便、快速，分析準(zhǔn)確，適合對長春花內(nèi)主要生物堿做高通量的篩選。綜合考慮總堿的含量和最重要的長春堿的含量，1號品種適合作為代謝調(diào)控的本體。[JP]

【關(guān)鍵詞】 長春花；長春堿；長春質(zhì)堿；文多靈；RP-HPLC

【中圖分類號】R2841 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）24-0010-04

Determination of three kinds of important alkaloids in Catharanthus roseus from ten different habitats

ZHAN Xiao-ning

The first affiliated hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China

Abstract：Objective To establish a fast and accurate method of determination of alkaloids in Catharanthus roseus for finding high-content varieties. Method To determinate the contents of Vinblastine， Catharanthine and Vindoline in the 10 varieties of Catharanthus roseus by RP-HPLC，HPLC method is performed on Dikma Diamonsil - C18 （46mm×250mm， 5μm）column， mobile phase：A：07% diethylamine（pH 72 adjusted by phosphoric acid ）；B：acetonitrile∶methanol =25∶40.A∶B = 35∶65； flow rate is 1ml/min.Column temperature is 35 ℃. Detected at 280nm.Results Vindoline：Y=200×106X+546×104，r=09999，linear range：02 ～ 4μg；Catharanthine：Y=228×106X+831×104，r=09999，linear：02 ～ 4μg；Vinblastine：Y=176×106X-717×104，r=09999，linear range：02～ 4μg.The species of the highest content of vindoline is the 1st， Catharanthine is the 3rd， vinblastine is the 2nd species， the highest sum of three alkaloids is on the 3rd varieties.Conclusion This method is simple， reliable， repeatable， and is suitable for High-throughput screening of the Alkaloids content in Catharanthus roseus. The 1st varieties is suitable as the body of metabolic regulation.

Keywords：Catharanthus roseus； vinblastine； catharanthine； vindoline； RP-HPLC

長春花Catharanthus roseus （L. ） G. Don 為夾竹桃科（Apocynaceae） 長春花屬（Catharanthus） 植物，原產(chǎn)于非洲東海岸，現(xiàn)廣泛分布于世界各地，我國的廣東、廣西、云南、海南、貴州、四川以及江浙一帶均有栽培。作為一種傳統(tǒng)的民間藥用植物，長春花常被用來治療瘧疾、腹瀉、糖尿病、高血壓、皮膚病及何杰金氏病等。長春花的主要活性成分生物堿（Alkaloids）是植物天然次生代謝產(chǎn)物中數(shù)量最多的一類含氮堿性化合物。許多生物堿由于具有特殊的藥理學(xué)活性已引起人們越來越多的關(guān)注。長春花中含有的長春堿（Vinblastine）是一類重要的抗腫瘤萜類吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids， TIAs） [1]，在臨床上主要用于治療何杰金氏病和絨毛上皮癌，對淋巴肉瘤、黑色素瘤、卵巢癌、白血病等也有一定療效，是目前廣泛應(yīng)用的抗腫瘤植物藥之一[2]。此外，文多靈和長春質(zhì)堿還是合成長春堿的前體[3]。目前，長春堿、長春新堿和長春瑞賓已經(jīng)用于臨床[4]。長春花類生物堿的主要來源依然是從天然植物中提取，但這些生物堿在天然長春花植株中含量較低，隨著市場需求的增加，從天然長春花植株中提取生物堿不能滿足市場需求。利用細(xì)胞培養(yǎng)等方法生產(chǎn)長春花生物堿的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但是大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞生物堿產(chǎn)量很低[5]，而且由于培養(yǎng)細(xì)胞中不表達(dá)一些合成途徑的關(guān)鍵基因，使得部分生物堿無法在培養(yǎng)細(xì)胞中合成[6]，因此還不具備投入生產(chǎn)的潛力。近年來，旨在提高長春花植株中生物堿含量的研究開展很廣泛，特別是利用代謝調(diào)控的方法獲得生物堿含量高的長春花品種獲得了較大進(jìn)展[7]，因此我們需要尋找現(xiàn)有品種中生物堿含量高的品種，以其為研究對象，利用代謝調(diào)控方法獲得高含量的長春花品種，解決現(xiàn)有的資源不足的問題。

本研究利用RP-HPLC[8]方法對收集到的10種長春花品種中的文多靈、長春質(zhì)堿和長春堿的含量進(jìn)行分析，以期獲得長春花類生物堿含量高的品種。

1 儀器與試劑

11 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色譜工作站（美國Waters公司）；DL-720B型超聲水?。ㄉ虾Ｖ艃x器有限公司）；DHG-9075A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型電子天平（德國賽多利斯儀器公司）； PHS-3TC型pH計（上海天達(dá)儀器有限公司）；Ultrapure uvf純水儀（上海和泰儀器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海魯伊工貿(mào)有限公司）。

12 試劑 文多靈批號2182-14-1，2100-2011；長春質(zhì)堿批號2468-21-5，10605-2011；長春堿批號143-67-9，9011-2010，購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純， 二乙胺、磷酸為分析純，水為高純水。

13 材料 本實驗選用長春花購于美國泛美種子公司，包括太平洋系列品種5種，清涼系列品種2種，大力神系列品種3種。10種長春花藥材均種植于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院農(nóng)場。采用溫室大棚種植，溫度保持在20℃以上。于8月采集樣品，每個品種隨機(jī)選取3株，收集植株的葉子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；準(zhǔn)確稱量干粉各05g，將同一品種的3份干粉混合均勻后保存于4℃冰箱備用。

2 實驗方法

21 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 精密稱取三種標(biāo)準(zhǔn)樣品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超聲20min使之溶解后，定容至刻度，濃度為1mg/ml。經(jīng)04μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。使用時根據(jù)需要用色譜純甲醇稀釋。

22 測試樣品的制備方法的選擇

221 提取溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱取同一樣品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分別精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超聲（功率600W，頻率99 kHz）提取30min，放冷，分別補(bǔ)加相應(yīng)溶劑至刻度，搖勻，045μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10μl，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明以甲醇作溶劑，文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿的提取率均高于其他溶劑，故本法采用甲醇作為提取溶劑。

222 提取方法的選擇 冷浸法：樣品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，離心后傾出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；超聲法：1g樣品，加甲醇10ml，超聲半小時，離心后傾出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；熱回流法：樣品1g，加10ml甲醇，60℃熱回流提取3次，合并提取液減壓蒸干，5ml甲醇定容。將3種方法提取液分別過045μm微孔濾膜，進(jìn)樣10μl，測得熱回流和超聲法提取效率均高于冷浸法，考慮到試驗的可操作性和安全性，故選擇超聲法提取。

通過進(jìn)一步的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)用5倍量的甲醇超聲2次，即能提取完全，超聲前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最終選定測試樣品制備方法為：精密稱取樣品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超聲30min，12000rpm離心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，離心，合并兩次的上清液，減壓干燥至恒重，1ml甲醇定容；經(jīng)045μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

23 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色譜柱。流動相為A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸調(diào)整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱溫35℃；檢測波長：280nm；進(jìn)樣量為40μl。文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿與相鄰色譜峰分離度均大于15，理論塔板數(shù)按三者的峰計算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范圍內(nèi)。文多靈、長春質(zhì)堿和長春堿的保留時間分別為9909、13819、17206min。

24 精密度試驗 取21項下標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣40μl，重復(fù)6次，測得三種生物堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

25 穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品液40μl，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定三種生物堿的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為140%、094%、161%，表明供試品液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

26 重復(fù)性實驗 準(zhǔn)確稱取同一樣品6份，每份02g，按照23項下色譜條件進(jìn)行測定，三種生物堿的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為198%、145%、138%，表明方法重復(fù)性良好。

27 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（樣品1）3份，每份02g，分別加入上述混合標(biāo)準(zhǔn)品02，04，08ml，形成高、中、低3個濃度，依照上述方法進(jìn)行樣品處理和測定，計算三種生物堿的回收率，結(jié)果平均回收率分別為10284%、9886%、9773%，RSD分別為135%、209%、245%，表明方法加樣回收率良好。

28 色譜峰純度分析 采用Empower 軟件系統(tǒng)對樣品中的文多靈，長春質(zhì)堿和長春堿分析峰純度，峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖1） ，色譜峰純度角值小于閾值，表明吸收峰為光譜純。通過分別和文多靈，長春質(zhì)堿，長春堿的標(biāo)準(zhǔn)品的光譜曲線匹配，亦匹配良好。

29 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至01μg/μl，用自動進(jìn)樣器分別進(jìn)樣5級標(biāo)準(zhǔn)：分別精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，上述色譜條件洗脫，測定峰面積。通過Empower軟件制作以文多靈，長春質(zhì)堿，長春堿進(jìn)樣量X（單位：μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（單位：微伏*秒） 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 文多靈回歸方程為Y=200×106X+546×104， r=09999，線性范圍為02～40μg。長春質(zhì)堿回歸方程為Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍為02～40μg。長春堿回歸方程為Y=176×106X-717×104 ，r=09999，線性范圍為02～40μg。

3 實驗結(jié)果

按上述方法對10份長春花樣品進(jìn)行測定。每批重復(fù)測定3次，結(jié)果見表1。

4 討論

在長春花樣品制備的方法中，常見的有甲醇提取法和酸液提取-堿化后有機(jī)溶劑萃取法[9]。通過比較發(fā)現(xiàn)，甲醇提取效率高，速度快，雖然提取物中含有較多雜質(zhì)，然而通過改變洗脫條件，可以讓目的成分和雜質(zhì)有效分離，并不影響測定。酸液提取-堿化后有機(jī)溶劑萃取法的提取物中雖然雜質(zhì)較少，但是操作復(fù)雜，步驟繁多。本研究旨在多品種間的橫向比較，故盡量采用簡便的操作辦法，回避操作誤差，因此本研究采用甲醇提取法。通過優(yōu)化，采用1ml甲醇提取02g葉片干粉2次，操作可以縮小到2ml離心管內(nèi)進(jìn)行，便于大量操作。提取物濃度合適，通過適當(dāng)增加進(jìn)樣量，能夠保證含量較少的長春堿可以被檢測到。

在色譜條件的選擇中，流動相中甲醇和乙腈的比例對分離度和峰形均有較大影響，乙腈的增加有助于獲得良好的峰形，但當(dāng)乙腈比例大于25%時，長春質(zhì)堿會和樣品中的長春堿形成交叉，加入甲醇有助于兩者的分離。同時，在流動相中選擇二乙胺-磷酸溶液為緩沖體系，并通過調(diào)節(jié)溶液A與溶液B的比例使3種物質(zhì)得到較好的分離。在實驗中，當(dāng)A 的比例大于35%時，最后出峰的長春堿保留時間延長，當(dāng)A的比例小于35%時，長春堿保留時間前移和樣品中極性大的雜質(zhì)混出，難以得到滿意的分離度。因此，A∶B的比例在35∶65 時較為適宜。流動相的pH值對分離效果也有很大的影響，實驗以緩沖溶液調(diào)整流動相的pH值。將緩沖溶液的pH值分別設(shè)為50、60、70、72、74、76、和78，觀察pH值對峰形及分離效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)緩沖溶液pH值為72時，各峰間分離度增大，峰形較好，出峰時間適宜。因此，選擇緩沖溶液pH值為72。

本研究利用RP-HPLC[8]方法對收集到的10種長春花品種中的文多靈、長春質(zhì)堿和長春堿的含量進(jìn)行分析，以期獲得長春花類生物堿含量高的品種。

1 儀器與試劑

11 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色譜工作站（美國Waters公司）；DL-720B型超聲水?。ㄉ虾Ｖ艃x器有限公司）；DHG-9075A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型電子天平（德國賽多利斯儀器公司）； PHS-3TC型pH計（上海天達(dá)儀器有限公司）；Ultrapure uvf純水儀（上海和泰儀器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海魯伊工貿(mào)有限公司）。

12 試劑 文多靈批號2182-14-1，2100-2011；長春質(zhì)堿批號2468-21-5，10605-2011；長春堿批號143-67-9，9011-2010，購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純， 二乙胺、磷酸為分析純，水為高純水。

13 材料 本實驗選用長春花購于美國泛美種子公司，包括太平洋系列品種5種，清涼系列品種2種，大力神系列品種3種。10種長春花藥材均種植于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院農(nóng)場。采用溫室大棚種植，溫度保持在20℃以上。于8月采集樣品，每個品種隨機(jī)選取3株，收集植株的葉子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；準(zhǔn)確稱量干粉各05g，將同一品種的3份干粉混合均勻后保存于4℃冰箱備用。

2 實驗方法

21 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 精密稱取三種標(biāo)準(zhǔn)樣品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超聲20min使之溶解后，定容至刻度，濃度為1mg/ml。經(jīng)04μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。使用時根據(jù)需要用色譜純甲醇稀釋。

22 測試樣品的制備方法的選擇

221 提取溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱取同一樣品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分別精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超聲（功率600W，頻率99 kHz）提取30min，放冷，分別補(bǔ)加相應(yīng)溶劑至刻度，搖勻，045μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10μl，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明以甲醇作溶劑，文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿的提取率均高于其他溶劑，故本法采用甲醇作為提取溶劑。

222 提取方法的選擇 冷浸法：樣品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，離心后傾出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；超聲法：1g樣品，加甲醇10ml，超聲半小時，離心后傾出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；熱回流法：樣品1g，加10ml甲醇，60℃熱回流提取3次，合并提取液減壓蒸干，5ml甲醇定容。將3種方法提取液分別過045μm微孔濾膜，進(jìn)樣10μl，測得熱回流和超聲法提取效率均高于冷浸法，考慮到試驗的可操作性和安全性，故選擇超聲法提取。

通過進(jìn)一步的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)用5倍量的甲醇超聲2次，即能提取完全，超聲前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最終選定測試樣品制備方法為：精密稱取樣品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超聲30min，12000rpm離心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，離心，合并兩次的上清液，減壓干燥至恒重，1ml甲醇定容；經(jīng)045μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

23 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色譜柱。流動相為A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸調(diào)整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱溫35℃；檢測波長：280nm；進(jìn)樣量為40μl。文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿與相鄰色譜峰分離度均大于15，理論塔板數(shù)按三者的峰計算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范圍內(nèi)。文多靈、長春質(zhì)堿和長春堿的保留時間分別為9909、13819、17206min。

24 精密度試驗 取21項下標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣40μl，重復(fù)6次，測得三種生物堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

25 穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品液40μl，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定三種生物堿的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為140%、094%、161%，表明供試品液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

26 重復(fù)性實驗 準(zhǔn)確稱取同一樣品6份，每份02g，按照23項下色譜條件進(jìn)行測定，三種生物堿的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為198%、145%、138%，表明方法重復(fù)性良好。

27 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（樣品1）3份，每份02g，分別加入上述混合標(biāo)準(zhǔn)品02，04，08ml，形成高、中、低3個濃度，依照上述方法進(jìn)行樣品處理和測定，計算三種生物堿的回收率，結(jié)果平均回收率分別為10284%、9886%、9773%，RSD分別為135%、209%、245%，表明方法加樣回收率良好。

28 色譜峰純度分析 采用Empower 軟件系統(tǒng)對樣品中的文多靈，長春質(zhì)堿和長春堿分析峰純度，峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖1） ，色譜峰純度角值小于閾值，表明吸收峰為光譜純。通過分別和文多靈，長春質(zhì)堿，長春堿的標(biāo)準(zhǔn)品的光譜曲線匹配，亦匹配良好。

29 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至01μg/μl，用自動進(jìn)樣器分別進(jìn)樣5級標(biāo)準(zhǔn)：分別精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，上述色譜條件洗脫，測定峰面積。通過Empower軟件制作以文多靈，長春質(zhì)堿，長春堿進(jìn)樣量X（單位：μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（單位：微伏*秒） 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 文多靈回歸方程為Y=200×106X+546×104， r=09999，線性范圍為02～40μg。長春質(zhì)堿回歸方程為Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍為02～40μg。長春堿回歸方程為Y=176×106X-717×104 ，r=09999，線性范圍為02～40μg。

3 實驗結(jié)果

按上述方法對10份長春花樣品進(jìn)行測定。每批重復(fù)測定3次，結(jié)果見表1。

4 討論

在長春花樣品制備的方法中，常見的有甲醇提取法和酸液提取-堿化后有機(jī)溶劑萃取法[9]。通過比較發(fā)現(xiàn)，甲醇提取效率高，速度快，雖然提取物中含有較多雜質(zhì)，然而通過改變洗脫條件，可以讓目的成分和雜質(zhì)有效分離，并不影響測定。酸液提取-堿化后有機(jī)溶劑萃取法的提取物中雖然雜質(zhì)較少，但是操作復(fù)雜，步驟繁多。本研究旨在多品種間的橫向比較，故盡量采用簡便的操作辦法，回避操作誤差，因此本研究采用甲醇提取法。通過優(yōu)化，采用1ml甲醇提取02g葉片干粉2次，操作可以縮小到2ml離心管內(nèi)進(jìn)行，便于大量操作。提取物濃度合適，通過適當(dāng)增加進(jìn)樣量，能夠保證含量較少的長春堿可以被檢測到。

在色譜條件的選擇中，流動相中甲醇和乙腈的比例對分離度和峰形均有較大影響，乙腈的增加有助于獲得良好的峰形，但當(dāng)乙腈比例大于25%時，長春質(zhì)堿會和樣品中的長春堿形成交叉，加入甲醇有助于兩者的分離。同時，在流動相中選擇二乙胺-磷酸溶液為緩沖體系，并通過調(diào)節(jié)溶液A與溶液B的比例使3種物質(zhì)得到較好的分離。在實驗中，當(dāng)A 的比例大于35%時，最后出峰的長春堿保留時間延長，當(dāng)A的比例小于35%時，長春堿保留時間前移和樣品中極性大的雜質(zhì)混出，難以得到滿意的分離度。因此，A∶B的比例在35∶65 時較為適宜。流動相的pH值對分離效果也有很大的影響，實驗以緩沖溶液調(diào)整流動相的pH值。將緩沖溶液的pH值分別設(shè)為50、60、70、72、74、76、和78，觀察pH值對峰形及分離效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)緩沖溶液pH值為72時，各峰間分離度增大，峰形較好，出峰時間適宜。因此，選擇緩沖溶液pH值為72。

本研究利用RP-HPLC[8]方法對收集到的10種長春花品種中的文多靈、長春質(zhì)堿和長春堿的含量進(jìn)行分析，以期獲得長春花類生物堿含量高的品種。

1 儀器與試劑

11 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色譜工作站（美國Waters公司）；DL-720B型超聲水?。ㄉ虾Ｖ艃x器有限公司）；DHG-9075A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型電子天平（德國賽多利斯儀器公司）； PHS-3TC型pH計（上海天達(dá)儀器有限公司）；Ultrapure uvf純水儀（上海和泰儀器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海魯伊工貿(mào)有限公司）。

12 試劑 文多靈批號2182-14-1，2100-2011；長春質(zhì)堿批號2468-21-5，10605-2011；長春堿批號143-67-9，9011-2010，購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。甲醇、乙腈為色譜純， 二乙胺、磷酸為分析純，水為高純水。

13 材料 本實驗選用長春花購于美國泛美種子公司，包括太平洋系列品種5種，清涼系列品種2種，大力神系列品種3種。10種長春花藥材均種植于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院農(nóng)場。采用溫室大棚種植，溫度保持在20℃以上。于8月采集樣品，每個品種隨機(jī)選取3株，收集植株的葉子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；準(zhǔn)確稱量干粉各05g，將同一品種的3份干粉混合均勻后保存于4℃冰箱備用。

2 實驗方法

21 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 精密稱取三種標(biāo)準(zhǔn)樣品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超聲20min使之溶解后，定容至刻度，濃度為1mg/ml。經(jīng)04μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。使用時根據(jù)需要用色譜純甲醇稀釋。

22 測試樣品的制備方法的選擇

221 提取溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱取同一樣品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分別精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超聲（功率600W，頻率99 kHz）提取30min，放冷，分別補(bǔ)加相應(yīng)溶劑至刻度，搖勻，045μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10μl，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明以甲醇作溶劑，文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿的提取率均高于其他溶劑，故本法采用甲醇作為提取溶劑。

222 提取方法的選擇 冷浸法：樣品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，離心后傾出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；超聲法：1g樣品，加甲醇10ml，超聲半小時，離心后傾出上清液，重復(fù)3次，合并上清液，減壓蒸干，5ml甲醇定容；熱回流法：樣品1g，加10ml甲醇，60℃熱回流提取3次，合并提取液減壓蒸干，5ml甲醇定容。將3種方法提取液分別過045μm微孔濾膜，進(jìn)樣10μl，測得熱回流和超聲法提取效率均高于冷浸法，考慮到試驗的可操作性和安全性，故選擇超聲法提取。

通過進(jìn)一步的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)用5倍量的甲醇超聲2次，即能提取完全，超聲前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最終選定測試樣品制備方法為：精密稱取樣品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超聲30min，12000rpm離心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，離心，合并兩次的上清液，減壓干燥至恒重，1ml甲醇定容；經(jīng)045μm微孔濾膜過濾后保存于4℃冰箱。

23 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色譜柱。流動相為A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸調(diào)整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱溫35℃；檢測波長：280nm；進(jìn)樣量為40μl。文多靈、長春質(zhì)堿、長春堿與相鄰色譜峰分離度均大于15，理論塔板數(shù)按三者的峰計算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范圍內(nèi)。文多靈、長春質(zhì)堿和長春堿的保留時間分別為9909、13819、17206min。

24 精密度試驗 取21項下標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣40μl，重復(fù)6次，測得三種生物堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

25 穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品液40μl，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定三種生物堿的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為140%、094%、161%，表明供試品液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

26 重復(fù)性實驗 準(zhǔn)確稱取同一樣品6份，每份02g，按照23項下色譜條件進(jìn)行測定，三種生物堿的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為198%、145%、138%，表明方法重復(fù)性良好。

27 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（樣品1）3份，每份02g，分別加入上述混合標(biāo)準(zhǔn)品02，04，08ml，形成高、中、低3個濃度，依照上述方法進(jìn)行樣品處理和測定，計算三種生物堿的回收率，結(jié)果平均回收率分別為10284%、9886%、9773%，RSD分別為135%、209%、245%，表明方法加樣回收率良好。

28 色譜峰純度分析 采用Empower 軟件系統(tǒng)對樣品中的文多靈，長春質(zhì)堿和長春堿分析峰純度，峰純度圖中純度線均位于自動閾值線下方（圖1） ，色譜峰純度角值小于閾值，表明吸收峰為光譜純。通過分別和文多靈，長春質(zhì)堿，長春堿的標(biāo)準(zhǔn)品的光譜曲線匹配，亦匹配良好。

29 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至01μg/μl，用自動進(jìn)樣器分別進(jìn)樣5級標(biāo)準(zhǔn)：分別精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，上述色譜條件洗脫，測定峰面積。通過Empower軟件制作以文多靈，長春質(zhì)堿，長春堿進(jìn)樣量X（單位：μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（單位：微伏*秒） 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 文多靈回歸方程為Y=200×106X+546×104， r=09999，線性范圍為02～40μg。長春質(zhì)堿回歸方程為Y=228×106X+831×104，r=09999，線性范圍為02～40μg。長春堿回歸方程為Y=176×106X-717×104 ，r=09999，線性范圍為02～40μg。

3 實驗結(jié)果

按上述方法對10份長春花樣品進(jìn)行測定。每批重復(fù)測定3次，結(jié)果見表1。

4 討論

在長春花樣品制備的方法中，常見的有甲醇提取法和酸液提取-堿化后有機(jī)溶劑萃取法[9]。通過比較發(fā)現(xiàn)，甲醇提取效率高，速度快，雖然提取物中含有較多雜質(zhì)，然而通過改變洗脫條件，可以讓目的成分和雜質(zhì)有效分離，并不影響測定。酸液提取-堿化后有機(jī)溶劑萃取法的提取物中雖然雜質(zhì)較少，但是操作復(fù)雜，步驟繁多。本研究旨在多品種間的橫向比較，故盡量采用簡便的操作辦法，回避操作誤差，因此本研究采用甲醇提取法。通過優(yōu)化，采用1ml甲醇提取02g葉片干粉2次，操作可以縮小到2ml離心管內(nèi)進(jìn)行，便于大量操作。提取物濃度合適，通過適當(dāng)增加進(jìn)樣量，能夠保證含量較少的長春堿可以被檢測到。

在色譜條件的選擇中，流動相中甲醇和乙腈的比例對分離度和峰形均有較大影響，乙腈的增加有助于獲得良好的峰形，但當(dāng)乙腈比例大于25%時，長春質(zhì)堿會和樣品中的長春堿形成交叉，加入甲醇有助于兩者的分離。同時，在流動相中選擇二乙胺-磷酸溶液為緩沖體系，并通過調(diào)節(jié)溶液A與溶液B的比例使3種物質(zhì)得到較好的分離。在實驗中，當(dāng)A 的比例大于35%時，最后出峰的長春堿保留時間延長，當(dāng)A的比例小于35%時，長春堿保留時間前移和樣品中極性大的雜質(zhì)混出，難以得到滿意的分離度。因此，A∶B的比例在35∶65 時較為適宜。流動相的pH值對分離效果也有很大的影響，實驗以緩沖溶液調(diào)整流動相的pH值。將緩沖溶液的pH值分別設(shè)為50、60、70、72、74、76、和78，觀察pH值對峰形及分離效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)緩沖溶液pH值為72時，各峰間分離度增大，峰形較好，出峰時間適宜。因此，選擇緩沖溶液pH值為72。