香辛料提取物對(duì)枇杷灰斑病菌的抑制作用

曾志紅

(莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100)

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl)屬薔薇科(Rosaceae)多年生雙子葉植物常綠喬木，原產(chǎn)我國(guó)，主要分布在長(zhǎng)江以南各省。目前，隨著枇杷的廣泛種植，枇杷病害越來(lái)越嚴(yán)重，如斑點(diǎn)病和角斑病和灰斑病等，其中，灰斑病是枇杷較為常見(jiàn)的病害，［1，2］嚴(yán)重地影響了枇杷的產(chǎn)量和質(zhì)量。

據(jù)相關(guān)研究表明，生姜(Zingiber officinale Rosc.)、辣椒(Capsicum annuum L. )、花椒(Zanthoxylum bungeanum L. )和丁香(Syzygium aromaticum L. )的提取液對(duì)微生物有一定的抑制作用，［3－9］但是否對(duì)枇杷灰斑?。?0］有抑制作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究將為枇杷灰斑病的生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試香辛料植物

表1 香辛料植物

1.1.2 供試菌種與培養(yǎng)基

供試菌種:枇杷灰斑病菌(P.eriobotrifolia Guba)，由莆田學(xué)院生物與環(huán)境工程實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基:PDA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑的提取

將洗凈晾干的供試香辛料樣品粉碎，過(guò)40 目篩，稱(chēng)取10g 裝入250mL 三角瓶，加入100mL 蒸餾水浸泡12h，在70℃下水浴40min，然后經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，取上清液。殘?jiān)尤?00mL 蒸餾水再次提取并取上清液。將兩次上清液混合后濃縮至100mL，得到的藥劑濃度為0.1g/mL，置于4℃下保存。

1.2.2 藥效篩選

以PDA 培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，在25℃下將枇杷灰斑病菌培養(yǎng)至產(chǎn)孢后，再用無(wú)菌水將孢子稀釋成能在10 ×10 倍視野的顯微鏡下觀察到30－59 個(gè)分生孢子的懸浮液，取200ul 孢子懸浮液均勻涂于10mL PDA 培養(yǎng)基表面，凝固后再均勻放上5 個(gè)牛津杯，中間加入無(wú)菌水作為對(duì)照，周?chē)? 個(gè)分別加入濃度為均為0.1g/mL 的生姜、辣椒、花椒和丁香的水提液，依次編號(hào)為0、1、2、3、4，重復(fù)五次試驗(yàn)。置于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 天后，測(cè)量抑菌圈的直徑，縱橫各一次，取平均值。選擇抑菌效果較好藥劑進(jìn)行進(jìn)一步的抑菌性能測(cè)定。

1.2.3 抑制菌絲體生長(zhǎng)測(cè)定

選取丁香為藥品分別配制成0mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL 的含藥平板，從PDA 培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)4 天的菌絲移至含藥平板中央，3 次重復(fù)，在25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3天后測(cè)量菌絲直徑，計(jì)算抑制百分率，求出藥劑丁香的毒力回歸方程式及EC50和EC90。

1.2.4 抑制孢子萌發(fā)力測(cè)定

配制10mL 在10 ×10 倍視野下能觀察到30 ～59 個(gè)分生孢子的孢子懸浮液，然后取1mL 孢子懸液加入0mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL 中，以無(wú)菌水為對(duì)照，處理1 小時(shí)，然后分別移于PDA 培養(yǎng)基平皿上 (1mL/皿)，在25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察孢子萌發(fā)情況，求出每種藥劑的毒力回歸方程式及EC50和EC90。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種不同植物的藥效的篩選

由試驗(yàn)結(jié)果可看到:生姜、辣椒、花椒、丁香水提液周?chē)写笮〔坏鹊囊志?，說(shuō)明這四種水提物對(duì)枇杷灰斑病菌絲的生長(zhǎng)均具有抑制作用，而且抑菌圈直徑大小順序?yàn)槎∠悖纠苯罚旧净ń?見(jiàn)表2)，可見(jiàn)丁香的抑菌效果最好。

表2 四種水提物對(duì)枇杷灰斑病菌的影響

2.2 抑制菌絲體生長(zhǎng)測(cè)定

由結(jié)果可知丁香水提液對(duì)枇杷灰斑病菌絲的生長(zhǎng)具有抑制作用(見(jiàn)圖1)，其抑制作用隨著水提液濃度的減小而減弱(見(jiàn)表3)，通過(guò)DPS 軟件分析可得，抑制菌體生長(zhǎng)機(jī)率值(y)隨丁香對(duì)數(shù)濃度(x)變化的關(guān)系式為y =3.6437 +1.2979x，相關(guān)系數(shù)r 為0.9895，說(shuō)明抑菌率與其濃度極相關(guān)。由此可推算出當(dāng)抑菌率為50% 時(shí)，丁香濃度為11.09mg/mL;當(dāng)抑菌率為90% 時(shí)，丁香濃度為107.70mg/mL，即EC50為11.09mg/mL，EC90為107.70mg/mL (見(jiàn)表4)。

圖1 丁香抑制菌絲體生長(zhǎng)結(jié)果(左圖為空白對(duì)照)

表3 丁香水提液對(duì)枇杷灰斑病菌絲生長(zhǎng)的影響

表4 抑制菌絲體生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 抑制孢子萌發(fā)力測(cè)定

由圖2 可以看出丁香水提液對(duì)灰斑病孢子萌發(fā)具有抑制作用，而且抑制作用隨著丁香的濃度增大而不斷增大，具體變化趨勢(shì)(見(jiàn)表5)。通過(guò)DPS 軟件模擬函數(shù)變化的趨勢(shì)，得到機(jī)率(y)隨丁香對(duì)數(shù)濃度(x)變化的關(guān)系式得y =0.3182 +2.7846x，其相關(guān)系數(shù)r 為0.9609 ＞0.8000，說(shuō)明孢子萌發(fā)抑制率與丁香的濃度具有較強(qiáng)的相關(guān)性，當(dāng)抑制率為50% 時(shí)，丁香濃度為48.01mg/mL;當(dāng)抑制率為90% 時(shí)，丁 香 濃 度 為138.54mg/mL 即EC50為48.01mg/mL 和EC90為138.54mg/mL (見(jiàn)表6)。

圖2 丁香抑制孢子萌發(fā)結(jié)果(從左到右丁香的濃度依次為0、20.0、40.0、60.0、80.0mg/mL)

表5 丁香水提液對(duì)枇杷灰斑病孢子萌發(fā)的影響

表6 抑制孢子萌發(fā)力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論

枇杷灰斑病嚴(yán)重危害枇杷的葉和果，目前主要采取噴藥保護(hù)，而波爾液多、甲篆托布津和多霉靈等化學(xué)農(nóng)藥的使用，既污染環(huán)境又造成枇杷中農(nóng)藥殘留，同時(shí)由于灰斑病原菌的繁殖能力極強(qiáng)，易產(chǎn)生抗藥性，而且孢子隨風(fēng)傳播后導(dǎo)致的大面積感染，更增加防治的困難。從本試驗(yàn)結(jié)果可看出灰斑病的孢子比菌絲體不容易被殺死，也印證了灰斑病防治的困難。本試驗(yàn)選取花椒、丁香、生姜、辣椒四種可食用香辛料植物做為試驗(yàn)材料，對(duì)灰斑病的生物防治辦法進(jìn)行積極的探索，若將其開(kāi)發(fā)為植物源殺菌劑，將對(duì)人體無(wú)毒副作用，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)枇杷綠色儲(chǔ)運(yùn)將發(fā)揮重要作用。如何更有效提取丁香等食用香辛料植物的抑菌活性物質(zhì)值得進(jìn)一步的探討。

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