堿性嫩黃O 分子印跡聚合物的固相萃取性能研究

張峻菁，楊守仁

(1. 清遠市食品藥品檢驗所，廣東 清遠 511515;2. 清遠職業(yè)技術(shù)學院，廣東 清遠 511500)

堿性嫩黃O(Auramine O)又稱堿性槐黃、奧拉明O、金胺O 等，黃色粉狀物，溶于冷水、易溶于熱水及乙醇，溶液呈亮黃色。其化學結(jié)構(gòu)式如圖1。［1］

圖1 堿性嫩黃O(Auramine O)的化學結(jié)構(gòu)式

堿性嫩黃O 為芳香胺類工業(yè)染料，主要用于皮革、棉麻、紙、草編織品等的染色，亦用于印染棉織品，其色淀用于制墻紙、色紙、油墨和油漆等。為改善食品外觀，堿性嫩黃O 常被不法生產(chǎn)者添加在腐竹、腐皮、豆制品等食品中，以牟取非法利益，長期攝入會致癌、致畸、致突變性，嚴重危害人體健康。衛(wèi)生部《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》中堿性嫩黃O 被列為非食用物質(zhì)，歐盟亦不允許使用。［2］

目前中國暫沒有堿性嫩黃O 的標準分析方法。其檢測方法主要有高效液相色譜法、［3，4］高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法、［5－7］毛細管電泳法［7］等。由于堿性嫩黃O 在食品中一般只需要微量添加，給前處理和檢測都造成一定困難，因此，建立一種準確、可靠、簡便的前處理方法在食品安全領(lǐng)域有著重要的實際應(yīng)用價值。

本實驗合成了一種對堿性嫩黃O 具有特異識別性能的分子印跡聚合物，用該聚合物制作的固相萃取小柱在萃取過程中能同時實現(xiàn)分離和富集，［8－10］在簡化儀器分析前處理的同時提高準確度。結(jié)果顯示該小柱萃取性能優(yōu)良，可望應(yīng)用于食品、日化品中非法添加堿性嫩黃O 的檢測。

1 儀器與試藥

堿性嫩黃O (上海晶純生化科技股份有限公司，AR);丙烯酰胺(AM，成都市科龍化學試劑廠);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，上海晶純生化科技股份有限公司，AR);偶氮二異丁腈(AIBN，天津市科密歐化學試劑有限公司);甲醇(Merk，HPLC);甲醇、乙腈、乙酸、氨水(廣州市化學試劑廠，AR)。

紫外可見分光光度計(UV－1750，島津公司);固相萃取小柱及篩板(深圳逗點生物科技有限公司);SC－8L－150 數(shù)控固相萃取儀(廣州市智真生物科技有限公司);HH－6 型恒溫水浴鍋(金壇市宏華儀器廠);恒溫振蕩儀(金壇市富華儀器公司);RP－HPLC 高效液相色譜儀(島津，LC－10Ap plus，UV檢測器，LcSolution 色譜工作站)。

2 方法

2.1 聚合物的制備

稱取0.2g (約0.7mmol)堿性嫩黃O 置于250ml 的圓底燒瓶中，加入80ml 乙腈及20ml 甲醇溶解，加入丙烯酰胺(AM)0.1g (約1.5mmol)振蕩2h，以使AM 和堿性嫩黃O 充分作用，然后再加入二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)2ml (約10mmol)、30mg 偶氮異丁腈(AIBN)，超聲振蕩混勻后，通N2除氧15min 后密閉，置于65℃恒溫水浴中反應(yīng)24h，得到淡黃色聚合物。

將聚合物倒出，用濾紙過濾后包好后放入索氏提取器，用甲醇－氨水(V:V =85:15)洗脫堿性嫩黃O，直至洗脫液干凈，取出聚合物置于烘箱80℃下烘干，置干燥器保存。

空白聚合物的制備步驟相同，但是不用添加模板分子。

2.2 絡(luò)合量的測定

2.2.1 標準曲線 稱取堿性嫩黃O 0.1519g，用甲醇溶解、定容于500ml 的容量瓶中，得濃度為1.000mmol·L－1的母液，備用。吸取適量母液稀釋成濃度為0.01000 ～0.06000mmol·L－1的6 個標準溶液梯度系列。在431.5nm 波長下測定該系列標液的吸光度值A(chǔ)，以A 為縱坐標、濃度C (mmol·L－1)為橫坐標作圖，即得堿性嫩黃O 標準曲線。

2.2.2 絡(luò)合量Q 的測定 稱取模板聚合物:每份30mg，共10 份，分別置于50mL 具塞錐形瓶中;在個錐形瓶分別加入20ml 不同濃度的堿性嫩黃O標準溶液。置于振蕩器上振蕩24h;靜置澄清后，用一次性針筒吸取上層清液，用0.45u 濾膜過濾，取濾液直接(或根據(jù)需要稀釋后)用紫外分光光度法測量吸光度;根據(jù)標液被吸附前后吸光度的變化來計算模板聚合物的吸附量。

用相同方法測量空白聚合物的吸附量。

2.3 固相萃取實驗

2.3.1 固相萃取小柱的制作 分別稱取模板聚合物和空白聚合物各0.5g，以蒸餾水為勻漿劑，濕法裝入直徑8mm 的固相萃取小柱中，壓緊上篩板;用甲醇反復(fù)沖洗，制得堿性嫩黃O 分子印跡聚合物與非印跡聚合物固相萃取小柱。

2.3.2 固相萃取及洗脫 配制0.07mmol·L－1的堿性嫩黃O 標準溶液，取5ml 上樣，設(shè)定萃取時間，收集過柱液，用紫外法測定過柱液的吸光度，計算萃取率。

分別用甲醇－乙酸(V:V=85:15)、甲醇－氨水(V:V=85:15)12.5mL 洗脫，設(shè)定洗脫時間，收集洗脫液;直接或根據(jù)需要稀釋后用紫外法測定洗脫液吸光度，計算洗脫率。

2.4 HPLC 方法及樣品測定

2.4.1 色譜條件 C18柱(250mm×4.6mm，5μm，迪馬公司)，進樣量20μL，流動相甲醇－1%氨水(60∶40)，流速0.8mL·min－1，紫外檢測波長431.5nm。

2.4.2 市售腐竹樣品前處理及測定 取10g 普通市售腐竹，研磨粉碎后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入20ml 乙醇及5g 無水硫酸鈉，超聲15min，離心，上層清液過MIP 或NMIP 小柱，收集洗脫液過0.22um 膜，吸取濾液0.5mL 稀釋至10mL。按“2.4.1”項下方法測量堿性嫩黃O 的峰面積。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚合物的合成 通常模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的比例為1:4:20，本實驗經(jīng)比較研究采用的比例為0.7:1.5:10，得到的模板聚合物具有較好的選擇性和識別能力。

3.2 標準曲線 按2.2.1 項所述方法測定堿性嫩黃O 標準溶液的吸光度A，得到回歸方程為:A =29.60C+0.01 (r=0.9999)，表明溶液在0.01000 ～0.06000mmol·L－1的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.3 絡(luò)合量的測定 按2.2.2 項所述方法，測定吸附前后底物濃度變化，吸附量的計算公式為Q=(C0－C) (V ×10－3)·M·1000/30 (C0為吸附前標準溶液的起始濃度、C 為吸附后溶液濃度、V為加入標準溶液的體積、M 為堿性嫩黃O 的分子量，Q 的單位為mg·g－1)。

表1 堿性嫩黃O 模板、空白聚合物的吸附量

圖2 MIP、NMIP 吸附量對比圖

從表1 及圖2 可看出，堿性嫩黃O 模板聚合物和空白聚合物的吸附量總趨勢是隨模板分子溶液的濃度增大而增大;不同的底物濃度，特別是在較高濃度下，模板聚合物比空白聚合物的吸附能力增強;模板聚合物的吸附量隨模板分子濃度的增大而逐漸呈現(xiàn)飽和趨勢，而空白聚合物呈現(xiàn)線性增加的趨勢，因此可認為模板聚合物對堿性嫩黃O 具有特異性識別的性能。

3.4 固相萃取實驗結(jié)果

3.4.1 萃取率 按2.3.1 項所述方法制作固相萃取小柱并進行萃取實驗，結(jié)果見表2。模板柱的一次性萃取率高達95.86%，明顯高于空白柱，說明模板柱為特異性吸附起主要作用，而空白柱為非特異性吸附起主要作用，呈現(xiàn)了較好的選擇性。

表2 模板、空白聚合物對堿性嫩黃O 的固相萃取結(jié)果

3.4.2 洗脫劑比較 按2.3.2 項所述方法洗脫被萃取的堿性嫩黃O。用甲醇－氨水(V:V=85:15)洗脫的效果較好，洗脫率平均在95%以上，用醇－乙酸(V:V=85:15)的洗脫率接近80%，因此采用甲醇－氨水(V:V=85:15)作為洗脫劑。

3.5 市售腐竹中堿性嫩黃O 的測定 按“2.4”項下方法處理及測量樣品，幾批次樣品均未檢出堿性嫩黃O。在3 個腐竹樣品中分別添加3 個不同水平(0.5、0.8、1.2μg·mL－1)的標準溶液，平均回收率介于91.4% ～96.2%。腐竹加標樣品溶液經(jīng)SPE 柱處理后，洗脫液呈現(xiàn)的HPLC 圖譜(見圖3)堿性嫩黃O 峰分離度較高，證明該SPE 柱具有較好的實用性。

圖3 堿性嫩黃O 標準品(A)

及腐竹固相萃取洗脫液(B)的高效液相色譜圖

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