苦菜總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的保護作用

劉仰斌，張志花，陳亞運

(贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

血腦屏障由毛細血管內(nèi)皮細胞、細胞間緊密連接、基底膜以及星形膠質(zhì)細胞三種結(jié)構(gòu)組成。它們可以阻止血液中的某些物質(zhì)向中樞轉(zhuǎn)運，從而保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腦缺血及再灌注時，由于缺血后大量的氧自由基產(chǎn)生，造成對腦血管的損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮水腫、膠質(zhì)細胞腫脹、基底膜損害、細胞間連接解離，破壞了血腦屏障的功能，腦微循環(huán)出現(xiàn)障礙，最終導(dǎo)致腦血管疾病的發(fā)生。

苦菜是一種食藥兩用的植物，藥理研究證實，苦菜具有較強的抗氧自由基、改善血液系統(tǒng)、抗血小板聚集、抗血栓形成、降低血脂等作用。［1－6］為進一步研究苦菜的藥理作用，特別是其在心腦血管方面的作用，筆者應(yīng)用大鼠MCAO(Middle cerebral artery occlusion)再灌注損傷模型，模擬臨床腦卒中(又稱中風(fēng))的癥狀，觀察苦菜總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)及通透性的影響。以期為苦菜在臨床上的應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 苦菜總黃酮按照劉仰斌等［1］建立的方法先配制好，濃縮成2.5g/mL 的溶液，并儲存于冰箱中以備實驗需要;伊文思藍 (Evans blue，EB)染料(上海恒遠生物科技有限公司)，4%多聚甲醛(上海譜振生物科技有限公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備 Gemini XPS 熒光酶標儀(美谷分子儀器上海有限公司);FA2004 電子稱(上海光學(xué)儀器廠);超速低溫離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司);H－9500 透射電子顯微鏡(日立高新技術(shù)上海國際貿(mào)易有限公司);手動勻漿機(江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠);高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies 公司);紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司);不銹鋼動物解剖臺(上海標普公司);大鼠尼龍線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動物分組 SPF 級SD 大鼠30 只，自由飲食，均為雄性，體質(zhì)量(230 ±20)g，由贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號為SYXK (贛)2007－0002。根據(jù)實驗動物使用的3R 原則，所有SD 大鼠在實驗前均給予人道的關(guān)懷，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗時30 只SD 大鼠隨機分為5 組(每組6只):假手術(shù)組、MCAO 再灌注模型組、MCAO 再灌注模型+苦菜總黃酮25.0mg/kg 組、50.0mg/kg 組、100.0mg/kg 組?？嗖丝傸S酮處理組大鼠于MCAO 手術(shù)后30min，10h，20h 尾靜脈注射給藥3 次;假手術(shù)組及MCAO 再灌注模型組大鼠于同時間點給予同體積的生理鹽水尾靜脈注射。

1.4 方法

1.4.1 MCAO 再灌注損傷模型的建立 參照Longa等［7］建立的方法制備好MCAO 模型，缺血2h 后進行再灌注，制成缺血再灌注模型。假手術(shù)組大鼠只暴露和分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不閉塞大腦中動脈。術(shù)中室溫嚴格控制在24℃－26℃。

1.4.2 大鼠血腦屏障通透性的測定 血腦屏障通透性采用腦組織中EB 含量來表示。大鼠處死前30min 尾靜脈注射EB 液0.25mL (0.5%，溶于生理鹽水)，直至四肢與尾部的黏膜變藍色為止。再灌注24h 后，麻醉各組大鼠，先用生理鹽水對大鼠進行心臟灌流，然后處死斷頭取腦，取缺血側(cè)前腦，稱重后，用7.5% 三氯乙酸勻漿 (3mL/g)。取一份勻漿液于12000g，4℃，離心20min，取上清液于620nm 處測定吸光度，以EB 系列濃度溶液制作標準曲線，進行EB 定量。結(jié)果以μg/g (腦濕重)表示EB 含量。

1.4.3 大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 上述方法取缺血側(cè)前腦后，余下大腦常規(guī)4%多聚甲醛內(nèi)固定，取缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)腦組織修成lmm ×lmm×lmm 小塊，2%多聚甲醛－戊二醛固定2h，1%鋨酸4℃固定2h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，純樹脂包埋，聚合，修塊后半薄切片，天青－美藍染色，光鏡下定位，超薄切片醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛染色，透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，實驗結(jié)果均以± S 表示，組間比較采用單因素(one－way ANOVA)方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦菜總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中EB 含量的影響 見表1。MCAO 模型組大鼠由于血腦屏障通透性增強，導(dǎo)致腦組織EB 含量顯著升高，與假手術(shù)相比具有顯著性差異(P ＜0.01)，苦菜總黃酮各劑量組可顯著降低腦組織中的EB 含量，與模型組相比有顯著性差異 (P ＜0.05 in 25.0mg/kg;P ＜0.01 in 50.0mg/kg 和100.0mg/kg組)，提示苦菜總黃酮能夠減輕由于MCAO 造成的腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性的改變，減少EB 的滲漏。

表1 苦菜總黃酮對大鼠腦組織中EB 含量的影響

2.2 苦菜總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響 見圖1。假手術(shù)組血腦屏障結(jié)構(gòu)完整，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整，血管周圍膠質(zhì)細胞足突和周細胞無明顯腫脹發(fā)生，血管壁結(jié)構(gòu)完整，管腔未受擠壓。模型組血管周圍有大量腫脹的膠質(zhì)細胞，表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，大量水腫液。血管周圍足突腫脹，與基膜分離，腫脹的星形膠質(zhì)細胞和周細胞壓迫血管，造成血管官腔變窄，引發(fā)血流障礙。給予苦菜總黃酮可顯著改善MCAO引發(fā)的腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障損傷。在25.0mg/kg 組，血腦屏障的星形膠質(zhì)細胞水腫程度明顯減輕，雖然周細胞仍存在腫脹現(xiàn)象，但與模型組相比，血管官腔明顯恢復(fù)，提示血流明顯恢復(fù)。當劑量提升至50.0mg/kg 和高劑量組100.0mg/kg時，血腦屏障結(jié)構(gòu)中周細胞腫脹得到顯著抑制，周圍星形膠質(zhì)細胞水腫亦得到顯著減輕，提示苦菜總黃酮對MCAO 引發(fā)的腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障損傷具有顯著的改善作用。

圖1 苦菜總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)為血管內(nèi)皮細胞、基底膜及星形膠質(zhì)細胞，三種結(jié)構(gòu)可以阻止血液中的某些物質(zhì)向中樞轉(zhuǎn)運，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用。腦缺血缺氧后，腦內(nèi)通過各種途徑和機制產(chǎn)生大量氧自由基，在再灌注時期由于之前抗氧化酶已經(jīng)大量消耗，自由基積累更為明顯，大量自由基進而引發(fā)生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞了膜結(jié)構(gòu)的完整性，膜的通透性增加，最終導(dǎo)致血腦屏障功能受損，腦組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，大分子物質(zhì)可進入腦組織間隙，引發(fā)腦水腫，［8，9］腦水腫又可加重腦缺血缺氧狀態(tài)，二者產(chǎn)生惡性循環(huán)，加劇了腦組織和腦細胞的損傷。因此，保護膜結(jié)構(gòu)的完整性，恢復(fù)血腦屏障功能，是臨床診療的方向之一。

作為一種民間食藥兩用的植物，在民間苦菜常用于清熱、解毒、涼血等。現(xiàn)代藥理研究［1－5］也證實，苦菜有改善造血系統(tǒng)、抗血栓形成、抗氧化、降血脂等功效。在前期的研究［1，2］中，發(fā)現(xiàn)苦菜總黃酮可提高抗氧化物酶的活性，促進自由基的清除，進而抑制氧化應(yīng)激，能有效保護離體缺血再灌注損傷心肌。另外，苦菜總黃酮能改善血液系統(tǒng)、抗血小板聚集、降低血液粘稠作用，其也可以通過這些途徑改善腦血管缺血缺氧狀態(tài)，從而保護腦組織和腦細胞。

總之，苦菜總黃酮可顯著減輕缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的破壞程度，降低血腦屏障的通透性，減輕腦水腫，具有重要的腦保護作用。另外，發(fā)現(xiàn)在3 個劑量的苦菜總黃酮當中，高劑量苦菜總黃酮組中的各指標更接近假手術(shù)組，顯示高劑量的苦菜總黃酮對血腦屏障的保護作用更好，說明苦菜總黃酮對血腦屏障的保護作用與其量效有一定關(guān)系。對于這個發(fā)現(xiàn)，有待于進一步的研究和開發(fā)。

［1］劉仰斌，李啟華，劉欣. 苦菜總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］. 鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，45(1):107－110.

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