纖維素酶法提取棉花根多糖的工藝優(yōu)化

包淑云，吳義來，張艷華，喻麗珍

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院;2. 安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241002)

棉花根又名土黃芪，性溫味甘，具有補(bǔ)中益氣、止咳平喘功效，主要用于中氣下陷、脾氣虛弱、氣虛咳喘，民間常用其治療咳嗽、哮喘、慢性支氣管炎，［1，2］其為錦葵科草棉Gossypium herbaceum L.、樹棉G.arboreum L. 及陸地棉G.hirsutum L. 等的根或根皮。據(jù)報道，棉花根可使老年小鼠紅細(xì)胞和腦內(nèi)丙二醛含量明顯下降，超氧化物歧化酶活性增高，SOD/MDA 的比值顯著升高;［3］棉花根的醇提物與水提物具有祛痰抗炎的功效。［4］對棉花根化學(xué)成分已有較多報道，主要含天冬酰胺、棉酚、樹脂等，但對多糖的研究較少。［5］因多糖具有如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等多種生物活性，［6］鑒于纖維素酶能夠有效破除細(xì)胞壁，降解纖維素，使細(xì)胞中的多糖溶解出來，提取效果較好，故探索用纖維素酶法提取棉花根多糖的工藝方法，為棉花根多糖的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉花根于2008 年10 月采收于安徽省蕪湖市弋江區(qū)農(nóng)田，經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為陸地棉Gossypium hirsutum L. 的根，洗凈晾干，經(jīng)粉碎得棉花根粉末;纖維素酶(活力15U/mg，上海伯奧生物科技有限公司);D－無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110833－200904，中國食品藥品檢定研究所);苯酚、無水乙醇、濃硫酸、檸檬酸、檸檬酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV－2550 紫外可見分光光度計(日本島津);FA2004 型電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);FW177 型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國勝電子實驗儀器廠);TDL－5 低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SHB－3 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DZF－6050 型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);Nicolet 380 傅里葉紅外光譜儀(美國熱電公司)

1.3 方法

1.3.1 吸收波長的選擇

準(zhǔn)確移取一定量的棉花根多糖提取液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按硫酸－苯酚法進(jìn)行顯色，在波長200 ～800nm 之間進(jìn)行掃描，以確定多糖的最大吸收波長。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg，蒸餾水溶解，定容至100mL，搖勻，配成200μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25mL 至50mL 的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得濃度分別為20、40、60、80、100μg/mL 葡萄糖溶液，再取上述不同濃度的葡萄糖溶液各0.5mL于具塞試管中，分別加5% 苯酚1.0mL、濃硫酸5.0mL，［7］搖勻，室溫放置30min。以蒸餾水作參比，于最大吸收波長處測定吸光度，并以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 棉花根多糖紅外光譜定性分析取少量的棉花根多糖樣品與適量的KBr 混合研細(xì)后壓片，在4000 ～400cm－1之間進(jìn)行紅外光譜掃描，得棉花根多糖的紅外光譜圖。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 酶解溫度對多糖提取率的影響

稱取5 份棉花根粉末5.0g，各加入纖維素酶0.8% (質(zhì)量比)，再加入pH 5.0 檸檬酸－檸檬酸鈉 緩 沖 液 50mL，分 別 于 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴鍋中酶解90min，移入100℃水浴鍋加熱5min，以滅活纖維素酶，各加入100mL 蒸餾水，90℃浸提2h，抽濾，90℃濃縮濾液至10mL，5000r/min 速度離心30min，除去沉淀，在溶液中加入4 倍體積無水乙醇，室溫靜置12h，多糖沉淀析出，用95%乙醇洗滌沉淀3 次，干燥得多糖后，加蒸餾水溶解并定容至50mL，取5mL 定容至100mL 得供試提取液，取0.5mL 于具塞試管中，各加5%苯酚1.0mL、濃硫酸5.0mL，搖勻，室溫放置30min。以蒸餾水為參比溶液，分別在484nm 處測定吸光度。

1.3.4.2 酶解時間對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份棉花根粉末5.0g，各加入纖維素酶0.8% (質(zhì)量比)，再加入pH 5.0 檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液50mL，于60℃水浴鍋中分別酶解30min、60min、90min、120min 和150min，后續(xù)操作同1.3.4.1。

1.3.4.3 酶解pH 對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6 份棉花根粉末5.0g，各加入纖維素酶0.8% (質(zhì)量比)，分別加入pH 4.0、pH 4.4、pH 4.8、pH 5.2、pH 5.6 和pH 6.0 檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液50mL，于60℃水浴鍋中酶解90min，后續(xù)操作同1.3.4.1。

1.3.4.4 酶添加量對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 份棉花根粉末5.0g，分別加入纖維素酶0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2% (質(zhì)量比)，再加入pH 5.0 檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液50mL，于60℃水浴鍋中酶解90min，后續(xù)操作同1.3.4.1。

1.3.5 正交實驗設(shè)計

根據(jù)棉花根多糖提取的單因素實驗結(jié)果，以纖維素酶法提取的酶解溫度、酶解時間、酶解PH 和酶添加量為考察因素，每個因素設(shè)3 個水平，采用L9(34)正交設(shè)計，確定纖維素酶法提取的最佳工藝參數(shù)。

1.3.6 棉花根多糖提取率的測定

準(zhǔn)確稱取5 份棉花根粉末5.0g，以最佳工藝條件進(jìn)行提取，提取步驟同1.3.4.1，測得的吸光度代入線性回歸方程求得C，再代入下式(式1)，即可求得棉花根多糖的提取率。

C 為樣品溶液的葡萄糖重量(μg)，D 為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，W 為樣品重量(μg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長的確定

精密吸取棉花根多糖提取液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5mL，分別置20mL 具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液1.0mL、濃硫酸5.0mL，搖勻，室溫放置30min 后在波長200 ～800nm 之間進(jìn)行掃描，二者的最大吸收波長在484nm 處，故選擇484nm作為定量測定波長，如圖1 所示。

圖1 吸收波長的選擇

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.3.2 方法，以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度值為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并作線性回歸，得線性回歸方程為y = 0.0057x + 0.0268，r =0.9994，表明在0 ～100μg/mL 范圍內(nèi)，其濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 棉花根多糖的紅外光譜

圖2 棉花根多糖的紅外光譜

由圖2 可見，棉花根多糖的紅外光譜呈現(xiàn)典型的多糖吸收特征，在3433cm－1波數(shù)出現(xiàn)一個吸收較強(qiáng)的寬峰，為羥基的伸縮振動;在2930cm－1波數(shù)峰較弱，為C－H 伸縮振動，890cm－1提示存在β－D 吡喃糖結(jié)構(gòu)。

2.4 單因素試驗

2.4.1 酶解溫度對多糖提取率的影響

在相同條件下，分別在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃酶解，觀察酶解溫度對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 酶解溫度對多糖提取率的影響

從圖3 可以看出，吸光度隨酶解溫度的升高逐漸增大，至60℃時吸光度最大，而超過60℃后，多糖提取率反而下降，推測與過高的溫度引起酶部分失活有關(guān)。根據(jù)實驗結(jié)果，選取55℃，60℃，65℃作為正交實驗中酶解溫度的3 個考察水平。

2.4.2 酶解時間對多糖提取率的影響

在相同條件下，分別酶解30min、60min、90min、120min 和150min，觀察酶解時間對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 酶解時間對多糖提取率的影響

由圖4 可知，隨著酶解時間的延長吸光度增大，當(dāng)酶解120min 時所得提取液的吸光度趨于最大，繼續(xù)延長酶解時間吸光度反而微微下降，可能是長時間的高溫提取導(dǎo)致了部分多糖分解所致，且過長的時間也可能導(dǎo)致酶活性的降低。從提取率和節(jié)能兩方面考慮，超出120min 的提取意義不大且能量損耗較多，故選100，120，140min 作為正交試驗中提取時間的3 個考察水平。

2.4.3 酶解pH 對多糖提取率的影響

在相同條件下，分別在pH 4.0、4.4、4.8、5.2、5.6 和6.0 下酶解，觀察酶解pH 對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 酶解pH 對多糖提取率的影響

由圖5 可見，隨著pH 升高，吸光度緩慢增加，至pH 5.6 時吸光度最大，隨后下降，故選pH 5.4，5.6，5.8 作為正交實驗中酶解pH 的3 個考察水平。

2.4.4 酶添加量對多糖提取率的影響

在相同條件下，分別加入0g、0.02g (纖維素酶與棉花根的質(zhì)量比為0.4%)、0.04g (質(zhì)量比0.8%)、0.06g (質(zhì)量比1.2%)和0.08g (質(zhì)量比1.6%)的纖維素酶，觀察酶添加量對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖6 所示。

由圖6 可見，隨著纖維素酶量的增多，吸光度緩慢增加，至酶量達(dá)到1.6%時吸光度最大，繼續(xù)增加酶量，吸光度反而減小。本實驗最佳酶用量為1.2 %，故選1.0 %、1.2 % 和1.4 % 作為正交實驗中酶添加量的3 個考察水平。

圖6 酶添加量對多糖提取率的影響

2.5 正交試驗

表1 L9(34)正交試驗與結(jié)果

表2 方差分析

由正交試驗結(jié)果得出最優(yōu)組合為A1B1C3D3，即最佳提取條件是酶解溫度55℃，酶解時間為100min，酶解pH5.8，酶添加量1.4%。由表2 可知，在不考慮交互作用情況下，各因素的影響順序為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度＞酶解pH。

2.6 驗證實驗

根據(jù)1.3.6 方法，在484nm 處測定吸光度后，將吸光度代入回歸方程及多糖提取率公式(式1)，得棉花根多糖的提取率為15.552‰(RSD=2.782%)。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗設(shè)計，對纖維素酶提取棉花根多糖的pH 環(huán)境、提取時間、提取溫度和酶用量4 個因素進(jìn)行考察研究，確定的優(yōu)化工藝條件是:酶解pH5.8，酶解時間100min，酶解溫度55℃，酶用量為1.4%。在此優(yōu)化工藝條件下，棉花根多糖的提取率為15.552‰，而超聲波提取法的多糖提取率為1.477%，［5］可見纖維素酶法的多糖提取率略高于超聲波提取法，推測與纖維素酶有效破除細(xì)胞壁而有助于多糖的溶出有關(guān)。有關(guān)棉花根多糖提取率的進(jìn)一步提高以及多糖的結(jié)構(gòu)和藥理作用仍需進(jìn)一步研究。

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