淀粉質食品中蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定

張 鋒，于 倩，徐 艷，顧 敏，楊 靜

(甘肅省分析測試中心，甘肅蘭州 730000)

淀粉質食品中蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定

張 鋒，于 倩*，徐 艷，顧 敏，楊 靜

(甘肅省分析測試中心，甘肅蘭州 730000)

[目的]分離鑒定淀粉質食品中的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。[方法]以淀粉質食品(低溫保藏的米飯)為原料，采用傳統(tǒng)方法對米飯中蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定，使用PCR技術做最終確定。[結果] 對低溫保藏米飯進行系列稀釋后在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上進行菌種分離，初步分離出菌株MF-2，表面光滑稍有光澤，呈現(xiàn)低凸起形，邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明；經革蘭氏染色為陽性，鏡檢為桿狀；經芽孢染色為有芽孢桿菌； MF-2號菌能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，并產酸，但不能分解D-甘露糖和α-乳糖,初步鑒定菌株MF-2為蠟樣芽孢桿菌。由16S rRNA基因序列同源性分析，結合形態(tài)觀察和生理生化鑒定，最終鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。 [結論] 研究可為食品質量安全提供理論和實踐依據。

蠟樣芽孢桿菌；PCR技術；分離；鑒定

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種革蘭氏陽性桿菌，能形成芽孢，在周圍環(huán)境中廣為存在，其中一些菌株極易污染食物而引起食物中毒，特別是在蛋白質和碳水化合物含量豐富的食品中，如乳類、米飯、奶制品、腐乳、魚、燒雞等。因食品沒有明顯的腐敗現(xiàn)象，除有時稍有發(fā)粘口感不爽外，感官基本正常，因此不易察覺，誤食幾率較大。此類蠟樣芽孢桿菌主要引起8種類型的食物中毒癥狀，主要表現(xiàn)為嘔吐及腹瀉癥狀；此外，它們還能引起傷口及眼睛的感染等其他一些非腸胃性感染[l-2]。

目前，我國對蠟樣芽孢桿菌采用的檢測方法為國家標準GB.14938-94及檢驗檢疫系統(tǒng)行業(yè)標準WS/T.82-1996[3]。整個檢測過程費時低效，造成貨物積壓，貨主經濟損失增大[4]。而PCR技術現(xiàn)已廣泛應用于生物及食品學科等眾多領域，尤其是在食品中致病微生物檢測方面具有很大的應用價值[5]。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且采用全密閉管檢測，不需后處理，避免交叉污染，具有特異性強、自動化程度高的特點[6]，并可有效解決PCR污染問題；PCR與其他的分子生物學技術的聯(lián)合應用[7]，使人們可定性、定量研究微生物菌落結構組成及數(shù)量變化，深入探索微生物菌落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動態(tài)變化過程，為全面快速準確地分析鑒定水體、空氣、土壤和食品等環(huán)境中的各種微生物提供了一種嶄新的技術工具和平臺。為此，筆者以淀粉質食品為來源采用PCR技術對其可能含有的蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定，以期為食品質量安全提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試原料。米飯冷卻后在冰箱中冷藏2 d后備用。

1.1.2主要試劑。氯化鈉、氫氧化鈉，廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心，分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，石家市旭瑞化工有限公司；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液；革蘭氏染色：草酸銨結晶紫染液，碘液，95%乙醇溶液，番紅染色液；芽孢染色：5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅染色液。

1.1.3主要儀器與設備。生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-2)、數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱(HPX-9272MBE)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272)，上海精宏實驗設備有限公司；手提式壓力蒸汽消毒器(YXQ·SG4b·280A)，上海醫(yī)用核子儀器廠；超凈工作臺(SW-CJ-100)，蘇州安泰空氣技術公司；干燥箱(GRX20)，上海精密科學儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHA-B)，金壇市醫(yī)療儀器廠；顯微鏡(XS-213A)，南京江南光電股份有限公司；紫外可見分光光度計(UVmini-1240)，尤尼柯(上海)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，美國伯樂；PCR儀(TC-512)，英國TECHNE。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制。

1.2.1.1主要培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。成分：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.6～7.8。制法：將除瓊脂以外在各成分溶解于水中，以NaOH溶液校正pH 7.6～7.8，分裝三角瓶(分裝以三角瓶容積的1/2～2/3為宜)，而后按培養(yǎng)基的量加入2%在瓊脂，0.1 MPa滅菌20 min后倒平板備用。

1.2.1.2細菌糖發(fā)酵培養(yǎng)基。糖發(fā)酵試驗——用于鑒定一般細菌糖或醇發(fā)酵試驗。成分：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.4，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液(BCP)1～2 ml，葡萄糖(或其他糖、醇，如：D-甘露糖、蔗糖、α-乳糖、麥芽糖)10 g。制法：將蛋白胨、氯化鈉和磷酸氫二鉀溶于蒸餾水中，校正pH，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，待呈紫色，在加入葡萄糖(或其他各糖)，使之溶解，分裝于試管中，最后將杜氏小管倒置放入試管中，使管內充滿培養(yǎng)液無氣泡。

1.2.2菌種的分離培養(yǎng)。

1.2.2.1制備稀釋液。 稱取米飯10 g，放置于盛有90 ml無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在水浴恒溫振蕩器中振蕩約2 h，使米飯與水充分混合，使細胞分散，即成為10-1稀釋度的米飯懸液；用移液槍吸取1 ml 10-1稀釋度的米飯懸液放入9 ml無菌生理鹽水混合均勻，即成為10-2稀釋度的米飯懸液；在用移液槍吸取1 ml 10-2稀釋度的米飯懸液放入9 ml無菌生理鹽水混合均勻，即成為10-3稀釋度的米飯懸液。如此反復，連續(xù)稀釋可依次制成10-3～10-7不同稀釋度的米飯稀釋液。

1.2.2.2平板接種培養(yǎng)。①倒平板：取無菌平皿6套，分別用記號筆標明10-4～10-6稀釋度各2套。取滅菌后冷卻至不燙手的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入相應標號的無菌平皿約15 ml，平放桌上待凝固。②涂布平板：用移液槍分別吸取10-4～10-6稀釋度的米飯懸液各0.1 ml，傾注于相應標號的無菌平皿中，火焰旁左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，右手持無菌玻璃涂棒，于平板培養(yǎng)基表面，將菌懸液自平板中央以同心圓方向輕輕向外涂布擴散，使之均勻分布。室溫下靜置5～10 min，使菌液侵入培養(yǎng)基，每個稀釋度接種2個平板。③培養(yǎng)：將接種的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2.3革蘭氏染色。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染4個步驟。經此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，則該菌屬于革蘭氏陰性菌。

1.2.2.4芽孢染色。芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當先用弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復染液(如番紅液)或襯托溶液(如黑色素溶液)處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。

1.2.3菌株生長曲線的測定與繪制。將分離的3種菌株(MF-1、MF-2、MF-3)分別接種入裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的三角瓶中，在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、3、4、5、6、7、8、9 h…取出，以未接種培養(yǎng)液調零點，將搖勻后的培養(yǎng)液倒入比色槽中測定其OD600值。

1.2.4糖發(fā)酵試驗。蠟樣芽孢桿菌菌種的鑒定主要是依據菌株對碳水化合物的發(fā)酵產酸試驗，即通過對糖、糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來區(qū)分。如果發(fā)酵管中加入糖，培養(yǎng)2～3 d后，培養(yǎng)液出現(xiàn)黃色，則表示該糖被利用并產酸，反應為陽性；如無任何變化者則表示該糖不被利用，反應為陰性。

該試驗進行下列糖的糖發(fā)酵試驗: 葡萄糖、D-甘露糖、蔗糖、α-乳糖、麥芽糖。將糖發(fā)酵培養(yǎng)基成分(指示劑除外)稱取、溶解、搖勻，調整pH，添加1.6%溴甲酚紫指示劑，按1%的濃度添加試驗糖類并溶解，分裝試管，每管5 ml，在121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后待用。取分離出的3個菌株分別接種于糖發(fā)酵培養(yǎng)基中進行糖發(fā)酵試驗，另外做空白試驗對照，接種后，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察結果。

1.2.516S rRNA基因序列同源性分析。

1.2.5.1模板的制備。收集1.5 ml對數(shù)生長期細菌細胞；在10 000 r/min離心5 min，去除上清液；用TE緩沖液沖洗2次，加TE緩沖液0.5 ml，振蕩，最終重新懸浮于1.5 ml的離心管中。細胞顆粒溶于500 μl TE緩沖液中并混勻，加入10 μl溶菌酶，在37 ℃水浴鍋中加熱20～30 min；加30 μl 10% SDS，5 μl蛋白酶K，混勻，在55 ℃水浴中加熱30 min；加100 μl NaCl (5 mol/L)混勻，再加80 μl的CTAB/NaCl混勻；55 ℃水浴10 min。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻(如果分層不明顯，則重復此步驟)，在10 000 r/min離心10 min去除上清液，加入2倍體積的95%乙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，在4 ℃冰箱中放置一個晚上，然后在10 000 r/min高速離心10 min，去除上清液，用70%乙醇沖洗2次，再加入200 μl TE緩沖液。

1.2.5.216S rRNA基因PCR擴增。 試劑：TaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司；引物：由上海生工有限公司合成；27f 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3(對應于E.coli的16S rRNA的第8～27堿基位置)；1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3(對應于E.coli的16S rRNA的1479～1492堿基位置)。

PCR反應體系(50 μl)：DNA模板(30～50 ng)，3 μl；dNTP混合物(終濃度:200 μmol),1 μl;TaqDNA聚合酶(1U),0.5 μl; 引物1為0.4 μmol，1 μl；引物2為0.4 μmol，1 μl；TaqDNA聚合酶10×緩沖液,5 μl;MgCl2，2 mmol/L,1 μl; 去離子水,37 μl。

1.2.5.3PCR產物檢測。3 μl擴增產物在1%瓊脂糖、50 μg/ml EB凝膠電泳上檢測，16S rRNA 基因大約1 450 bp，正向測序約700 bp。電泳結束后，置于BIO-RAD凝膠成像儀照相，保存為TIFF文件格式。

1.2.5.4PCR產物純化、測序[8-10]。 采用AxyprepTMPCR Cleanup Kit 純化PCR產物，擴增產物由上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.2.5.5數(shù)據處理。將所測得的16S rDNA序列用提交到GenBank數(shù)據庫中，用BLAST進行相關序列的搜索，與GenBank、EMBL、DDBJ等數(shù)據庫中現(xiàn)有的近緣菌株的序列比較，并從數(shù)據庫獲得相關屬、相關種的16S rDNA序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。序列用CLUSTAL X program軟件對齊，進化距離的計算應用鄰接法neighbor-joining method，采用p-distances法和Kimura-2parameter雙參數(shù)法進行，進化樹分支模式的穩(wěn)定性用MEGA v.4.1軟件分析，采用bootstrap法，重復次數(shù)為1 000，構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 純化培養(yǎng)(挑取單菌落)菌落特征的觀察和選擇：采用平板分離培養(yǎng)法長出的肉眼可見菌落，不同菌株的菌落形態(tài)特征各異，據此可在一定程度上鑒別微生物。從分離平板中選擇目的菌株的菌落進行純化培養(yǎng)。觀察菌落特征主要有：大小、表面形狀、隆起度、邊緣性狀、菌落性狀、表面光澤、菌落質地、顏色、透明度等。由此分離出3種菌株(MF-1、MF-2、MF-3)。

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取菌懸液一環(huán)在培養(yǎng)基平板上劃線，劃線完畢，將牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)特征，經涂片、染色和鏡檢為純種后再接種斜面。

菌落形態(tài)如圖1所示。MF-1：菌落為小菌落(2～3 mm)，表面光滑具有光澤，呈現(xiàn)低凸起形，邊緣整齊可形成圓形或近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色偏黃不透明。MF-2：菌落為小菌落(2～3 mm)，表面光滑稍有光澤，呈現(xiàn)低凸起形，邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明。MF-3：菌落為小菌落(2～3 mm)，表面光滑稍有光澤，呈現(xiàn)低凸起形，邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明。

2.2 革蘭氏染色涂片→干燥→固定→草酸銨結晶紫染液初染(1～2 min)→水洗→碘液媒染(1 min)→水洗→95%乙醇溶液脫色(30 s)→水洗→番紅復染(1～2 min)→水洗→濾紙吸干→鏡檢。

經革蘭氏染色，MF-1號菌呈現(xiàn)紅色，故為革蘭氏陰性菌，MF-2號菌和MF-3號菌呈現(xiàn)紫色，故為革蘭氏陽性菌(圖2)；且3種菌株都呈現(xiàn)為桿狀，故為桿菌。

2.3 芽孢染色制備菌懸液→染色(5%孔雀綠水溶液加熱染色15～20 min)→涂片、固定→脫色(水洗)→復染(0.5%番紅染色液染色2～3 min，傾去染液濾紙吸干)→鏡檢。

經芽孢染色后，MF-2號菌呈現(xiàn)為桿狀，芽孢為綠色，菌體為紅色，故為芽孢菌；MF-3號菌呈現(xiàn)為桿狀，均為紅色，故無芽孢(圖3)。

2.4 菌株生長曲線的測定與繪制以細菌懸液的光密度值(OD值)為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制出MF-2號菌的生長曲線，見圖4。

2.5 糖發(fā)酵試驗葡萄糖、蔗糖和麥芽糖發(fā)酵管顏色由原來的紫色變?yōu)辄S色，則表示MF-2號菌能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，并產酸；D-甘露糖和α-乳糖發(fā)酵管顏色為紫色，沒有變化，則表示MF-2號菌不能分解D-甘露糖和α-乳糖(表1，圖5)。

表1 MF-2號菌糖發(fā)酵試驗測定結果

培養(yǎng)基及試驗MF-2號菌結果葡萄糖+蔗糖+D-甘露糖-α-乳糖-麥芽糖+

注：“+”，“-”分別表示糖發(fā)酵試驗反應結果為陽性和陰性。

2.6 16S rRNA基因序列同源性分析DNA雜交后，同源性在70%以上屬于種的水平；在20%以上，所試驗的菌株可能屬于同一個屬的成員。16S rRNA基因序列分析法原理是：如果兩株細菌的親緣關系比較接近，那么它們的rRNA序列同源性比較高，一般認為序列同源性超過97.5%以上為同一個種。

對分離菌株進行PCR擴增得到菌株的16S rDNA，經過電泳檢測(圖6)，由上海生工公司測序，將所測得的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據庫中，用BLAST進行相關序列的搜索，與GenBank、EMBL、DDBJ等數(shù)據庫中現(xiàn)有的近緣菌株的序列比較，并從數(shù)據庫獲得相關屬、相關種的16S rDNA序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)。結果表明，菌株MF-2與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)同源性達98%。根據分子生物學測序結果，結合形態(tài)觀察和生理生化現(xiàn)象，鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

3 結論

對低溫保藏米飯進行系列稀釋后在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上進行菌種分離，初步分離出菌株MF-2，表面光滑稍有光澤，呈現(xiàn)低凸起形，邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明；經革蘭氏染色為陽性，鏡檢為桿狀；經芽孢染色為有芽孢桿菌； MF-2號菌能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，并產酸，但不能分解D-甘露糖和α-乳糖。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,初步鑒定菌株MF-2為蠟樣芽孢桿菌。

由16S rRNA基因序列同源性分析，結合形態(tài)觀察和生理生化鑒定，最終鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

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Isolation and Identification ofBacilluscereusin Starches

ZHANG Feng, YU Qian*, XU Yan et al

(Gansu Analysis Research Center, Lanzhou, Gansu 730000)

[Objective] To isolate and identificateBacilluscereusin starches. [Method] With starchy food(low temperature preservation steamed rice) as raw material, traditional method was adopted to isolate and identifyBacilluscereusin steamed rice, PCR technology was used for final determination. [Result] A sequence of dilution was conducted on low temperature preservation steamed rice, and bacteria isolation was carried out on beef extract peptone agar medium. MF-2 was preliminarily isolated. MF-2 bacteria could utilize glucose, sucrose and maltose, produce acid, but can not degrade D- galactose and lactose. Through 16S rRNA gene sequence homology analysis, combined with morphological observation and physiological and biochemical identification,Bacilluscereuswas identified finally. [Conclusion] The study can provide theoretical and practical basis for food quality safety.

Bacilluscereus; PCR technique; Isolation; Identification

張鋒(1981-)，男，甘肅慶陽人，助理研究員，從事食品科學、食品檢測研究。*通訊作者，碩士，從事農產品貯藏及加工、食品檢測研究。

2015-03-26

S 182

A

0517-6611(2015)13-263-04