基于16S rDNA基因文庫(kù)的黃河三角洲鹽生植被土壤細(xì)菌群落多樣性研究

張 玥，姜愛(ài)霞，郭篤發(fā)

(山東師范大學(xué)人口·資源與環(huán)境學(xué)院，山東濟(jì)南 250014)

基于16S rDNA基因文庫(kù)的黃河三角洲鹽生植被土壤細(xì)菌群落多樣性研究

張 玥，姜愛(ài)霞，郭篤發(fā)*

(山東師范大學(xué)人口·資源與環(huán)境學(xué)院，山東濟(jì)南 250014)

[目的]研究黃河三角洲光板地及2種鹽生植被(獐茅和羅布麻)下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，探究其與植被演替的關(guān)系。[方法]采用細(xì)菌16S rDNA基因文庫(kù)方法，各文庫(kù)挑選200個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]光板地、獐茅和羅布麻3個(gè)文庫(kù)中分別得到121、150、155條有效序列。獐茅土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)最高。土壤中檢測(cè)到變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等共8門(mén)。變形菌門(mén)在光板地、獐茅土壤和羅布麻土壤中的相對(duì)豐度分別為37.45%、51.09%、37.11%，擬桿菌門(mén)分別為33.02%、3.03%、4.47%，其他細(xì)菌相對(duì)豐度均較低。[結(jié)論]3種覆被類(lèi)型下土壤細(xì)菌在種群組成與分布上差異明顯，變形菌為優(yōu)勢(shì)菌群。當(dāng)鹽生植被處于不同演替階段時(shí)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差別較大。

16S rDNA；黃河三角洲；細(xì)菌群落多樣性；鹽生植被

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其對(duì)土壤中幾乎所有過(guò)程都起著直接或間接的作用。在土壤微生物中，細(xì)菌的數(shù)量和種類(lèi)最多[1]，其群落結(jié)構(gòu)多樣性的變化對(duì)土壤肥力、植被生長(zhǎng)和污染物降解等具有重要影響，是評(píng)價(jià)自然及人為因素引起的土壤質(zhì)量變化的重要指示因子[2]。

土壤細(xì)菌起初被認(rèn)為呈全球隨機(jī)性分布[3-4]，后來(lái)的研究將多種影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的因素歸納為自然和人為兩大類(lèi)[5]，自然因素中的植物群落演替與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)變化與植被出現(xiàn)與否無(wú)關(guān)，表明植被對(duì)微生物的作用可能還與植被類(lèi)型或植被演替階段有關(guān)[6]。盡管植被群落與土壤微生物關(guān)系的研究取得了較大進(jìn)展，但在濱海鹽漬環(huán)境中，土壤細(xì)菌群落多樣性的變化與鹽生植被演替的關(guān)系尚不明晰。

筆者采用近年來(lái)在細(xì)菌多樣性領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的16S rDNA克隆文庫(kù)技術(shù)，研究黃河三角洲鹽生植被土壤細(xì)菌群落多樣性，探究其與植被演替的關(guān)系，為進(jìn)一步研究黃河三角洲自然保護(hù)區(qū)濕地生態(tài)系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集在黃河三角洲研究區(qū)內(nèi)沿東西向路線(橫跨現(xiàn)代三角洲和近代三角洲)，依照鹽生植被正向演替順序，于2012年6月選擇光板地、一種強(qiáng)耐鹽植被獐茅、一種輕耐鹽植被羅布麻，每個(gè)植被群落取3個(gè)樣地，每個(gè)樣地采用對(duì)角線五點(diǎn)采樣法采集土壤樣品。

采集0～20 cm深的土壤樣品，并混合均勻，除去較大的根系等雜物，分成2份，每份約200 g。一份土樣封于滅菌袋中，保存在4 ℃條件下，用于微生物培養(yǎng)和土壤理化性質(zhì)分析；另一份土樣放入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80 ℃條件下，用于分子生物學(xué)研究。

1.2 DNA提取使用Omega DNA提取試劑盒對(duì)土壤樣品DNA進(jìn)行提取，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。

1.3 細(xì)菌16S rDNA 的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增所用引物為：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1525R (5′-AGA-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。PCR反應(yīng)體系的各組分組成為：引物(10 pmol/L)各0.4 μl ，DNA模版1.0 ng，MgCl2(2.5 mmol/L) 0.3 μl，10×Buffer 2.0 μl，dNTP(2.5 mmol/L)0.4 μl，DNA聚合酶0.2 μl，Milli-Q Water補(bǔ)至20 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用熒光染料作為標(biāo)記，用0.8%(W/V)的瓊脂糖凝膠在1×TAE的緩沖液中進(jìn)行電泳測(cè)定。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序使用試劑盒(Tiangen Biotech Beijing)回收16S rDNA片斷并進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物連接至pMD 19-T Vector載體上，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞中。在含有氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板上分別涂布，37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜。利用T7和SP6進(jìn)行菌落PCR。PCR擴(kuò)增后檢驗(yàn)，挑選插入目的片斷的陽(yáng)性克隆子，送山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物信息技術(shù)服務(wù)中心測(cè)序。

1.5 序列分析及發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將測(cè)序所得序列在BLASTN中進(jìn)行同源性比對(duì)，挑選與序列親緣關(guān)系最相似序列，使用CHECK-CHIMERA軟件分析檢查，去除嵌合及怪異序列。利用ClustalW2軟件將測(cè)定的序列和部分網(wǎng)上下載的16S rDNA相似序列進(jìn)行多重分析比對(duì)，找出可操作分類(lèi)單元(OTU)。使用Mega5.0軟件中的鄰接法建構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 多樣性指數(shù)計(jì)算使用Mothur軟件進(jìn)行土壤細(xì)菌α多樣性分析，計(jì)算α多樣性指數(shù)，包括豐富度指數(shù)(Richness)、覆蓋率(Coverage)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)黃河三角洲土壤可溶性鹽分主要為NaCl，土壤電導(dǎo)率與鹽分含量能用線性進(jìn)行模擬[7]，因此可用土壤電導(dǎo)率表征土壤含鹽量。由表1可知，3種鹽生植被下土壤1∶5土水比浸提液的電導(dǎo)率在0.04～1.95 dS/m。光板地、獐茅地為海積潮濕正常鹽成土，其中光板地鹽化程度比獐茅地高很多，羅布麻地為弱鹽淡色潮濕雛形土；根據(jù)國(guó)際土壤質(zhì)地分類(lèi)制，光板地屬于粉砂壤土，獐茅地屬于粉砂黏壤土。有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮在獐茅和羅布麻土壤中的含量均高于光板地，羅布麻地速效磷含量高于光板地和獐茅地，差異明顯。由此可知，土壤速效磷隨鹽生植被正向演替有不斷升高的趨勢(shì)。光板地的溫度高于其他覆被類(lèi)型。

表1 不同覆被類(lèi)型土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤細(xì)菌測(cè)序深度及多樣性分析由圖1可知，OTU數(shù)目隨序列數(shù)增多而增加，但增幅逐漸變小，曲線趨于平緩，但仍未達(dá)到飽和，表明挑取的克隆數(shù)能基本反映土壤樣品中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成。由表2可知，3種覆被類(lèi)型下土壤細(xì)菌覆蓋率在52.67%～61.67%，表明黃河三角洲土壤細(xì)菌具有較高的多樣性。獐茅土壤Shannon指數(shù)最高，為8.52，說(shuō)明獐茅土壤細(xì)菌具有較高的多樣性，光板地Shannon指數(shù)最低，為7.19。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在3種土壤中差異明顯，獐茅土壤ACE指數(shù)最高，為31 554.68，獐茅土壤ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均最高，分別為3 155.68和18 806.41。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析表明，土壤理化性質(zhì)與各多樣性指數(shù)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

表2 不同土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.3 土壤細(xì)菌16S rDNA序列分析通過(guò)Mothur分析，將相似性大于97%的序列歸為同一種OTU，得到有效序列和OTU分析結(jié)果：光板地有效序列121個(gè)，OTU 72個(gè)；獐茅有效序列150個(gè)，OTU 83個(gè)；羅布麻有效序列155個(gè)，OTU 88個(gè)。

對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌序列主要?dú)w屬于8個(gè)門(mén)類(lèi)：變形菌門(mén)(Proteobacteria)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)，綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)。8種土壤細(xì)菌門(mén)在3種土壤中的分布情況見(jiàn)圖2。由圖2可知，變形菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度為37.11%～51.09%，為優(yōu)勢(shì)菌群，經(jīng)相關(guān)性分析，δ-變形菌(δ-Proteobacteria)與土壤全氮相關(guān)系數(shù)為0.89 (P<0.05)，顯著相關(guān)；擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度次于變形菌門(mén)，且在3種土壤中的分布差異明顯，為3.03%～33.02%，光板地中相對(duì)豐度最高，經(jīng)相關(guān)性分析，擬桿菌門(mén)與土壤電導(dǎo)率(含鹽量)相關(guān)系數(shù)為0.99 (P<0.01)，極顯著相關(guān)；酸桿菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度為0.21%～23.87%，在羅布麻土壤中相對(duì)豐度最高；放線菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度為2.32%～5.90%，在獐茅土壤中相對(duì)豐度最高；厚壁菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度為1.43%～4.22%，在羅布麻土壤中相對(duì)豐度最高，經(jīng)相關(guān)性分析，厚壁菌門(mén)與土壤含水率相關(guān)系數(shù)為0.94 (P<0.05)，顯著相關(guān)；綠彎菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度為0.81%～3.43%，在獐茅土壤中相對(duì)豐度最高；疣微菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度為0.37%～1.59%，在羅布麻土壤中相對(duì)豐度最高；異常球菌-棲熱菌門(mén)只在光板地中檢測(cè)到，相對(duì)豐度為0.23%。

2.3.1變形菌門(mén)。在獐茅土壤中相對(duì)豐度最高，為51.09%，有40個(gè)OTU。α-變形菌(α-Proteobacteria)含量最高，在獐茅土壤中相對(duì)豐度為14.67%，有17個(gè)OTU，其中12個(gè)屬于Rhodospirillales，3個(gè)屬于Rhizobiales，2個(gè)屬于Rhodospirillales；γ-變形菌(γ-Proteobacteria)相對(duì)豐度次之，為13.33%，有7個(gè)OTU，3個(gè)屬于綠膿桿菌(Pseudomonas)，1個(gè)屬于硫發(fā)菌目(Thiotrichales)，1個(gè)屬于海螺菌目(Oceanospirillales)，1個(gè)屬于交替單胞菌目(Alteromonadales)；β-變形菌(β-Proteobacteria)相對(duì)豐度為2.67%，有4個(gè)OTU，均屬于伯克氏菌目(Burkholderiales)；δ-變形菌(δ-Proteobacteria) 相對(duì)豐度最低，為2.00%，有3個(gè)OTU，1個(gè)OTU屬于互營(yíng)桿菌目(Syntrophobacterales)，1個(gè)屬于脫硫菌目(Desulfobacterales)，1個(gè)OTU屬于粘球菌目(Myxococcales)。

在光板地中相對(duì)豐度次之，為37.45%，有16個(gè)OTU。δ-變形菌含量最高，在光板地中相對(duì)豐度為5.79%，有7個(gè)OTU，其中6個(gè)OTU屬于脫硫菌目，1個(gè)屬于粘球菌目；γ-變形菌相對(duì)豐度次之，為4.96%，有5個(gè)OTU；α-變形菌相對(duì)豐度為1.65%；β-變形菌相對(duì)豐度為1.65%，有1個(gè)OTU，均屬于伯克氏菌目叢毛單胞菌科叢毛單胞菌屬(Comamonas)。

在羅布麻土壤中相對(duì)豐度最低，為37.11%，有13個(gè)OTU。γ-變形菌在羅布麻土壤中相對(duì)豐度最高，為9.68%，有4個(gè)OTU；δ-變形菌相對(duì)豐度次之，為3.23%，有5個(gè)OTU，全部屬于粘球菌目，β-變形菌相對(duì)豐度最低，為1.94%，有3個(gè)OTU，均屬于伯克氏菌目。

2.3.2擬桿菌門(mén)。擬桿菌門(mén)在光板地中相對(duì)豐度最高，為32.02%。有17個(gè)克隆體為擬桿菌綱(Bacteroidetes)，10個(gè)克隆體為海洋滑行菌屬(Marinilabilia)，4個(gè)克隆體屬于鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)；在羅布麻土壤中相對(duì)豐度次之，為4.47%，有13個(gè)OTU，全部為鞘脂桿菌綱；在獐茅土壤中相對(duì)豐度最低，為3.03%，有3個(gè)OTU，全部為鞘脂桿菌綱。

2.3.3酸桿菌門(mén)。在羅布麻土壤中相對(duì)豐度最高，為16.65%，有30個(gè)OTU，其中包含Gp4 6個(gè)OTU，Gp9 3個(gè)OTU，Gp5 3個(gè)OTU，Gp7 2個(gè)OTU，Gp26、Gp17、Gp1、Gp3各1個(gè)OTU；在獐茅地土壤中相對(duì)豐度次之，為7.01%，有5個(gè)OTU，分別屬于Gp26、Gp21、Gp4、Gp10；在光板地中相對(duì)豐度最低，只有0.21%，有2個(gè)OTU，分別屬于Gp3、Gp10。經(jīng)相關(guān)性分析，Gp7、Gp15與土壤有效磷相關(guān)系數(shù)均為0.90 (P<0.05)，顯著相關(guān)。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較由圖3可知，光板地與屬于重鹽土壤的獐茅土壤細(xì)菌及屬于輕鹽土壤的羅布麻土壤細(xì)菌間共有的OTU序列為16個(gè)，分別占三者OTU總數(shù)的66.67%、53.33%和80.00%；光板地與屬于重鹽土壤的獐茅土壤細(xì)菌間共有的OTU序列為5個(gè)，分別占兩者OTU總數(shù)的20.83%和16.67%；光板地與屬于輕鹽土壤的羅布麻土壤細(xì)菌間共有的OTU序列為0個(gè)；屬于重鹽土壤的獐茅土壤與屬于輕鹽土壤的羅布麻土壤細(xì)菌間共有的OTU序列為3個(gè)，分別占兩者OTU總數(shù)的10.00%和15.00%。由此可知，當(dāng)鹽生植被在不同演替階段時(shí)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差別較大。

3 結(jié)論與討論

該研究利用細(xì)菌16S rDNA基因文庫(kù)克隆測(cè)序技術(shù)，對(duì)黃河三角洲不同演替階段的代表性鹽生植被：光板地、獐茅和羅布麻的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，進(jìn)而明確其與植被演替的關(guān)系。變形菌門(mén)在3種植被土壤中為優(yōu)勢(shì)菌群，在屬于重鹽土壤的獐茅土壤中相對(duì)豐度最大，這與以往利用細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)方法對(duì)土壤樣品進(jìn)行研究所得結(jié)論基本一致。Tait等[8]對(duì)美國(guó)馬薩諸塞州礁湖的研究、Schloss等[9]對(duì)農(nóng)田土壤樣品細(xì)菌的研究、Axelrood等[10]對(duì)英國(guó)哥倫比亞森林土壤的研究，均發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群。擬桿菌門(mén)在3種土壤中相對(duì)豐度次于變形菌門(mén)，在光板地中相對(duì)豐度最高，其余2種土壤中相對(duì)豐度均低，且與土壤電導(dǎo)率(含鹽量)呈極顯著相關(guān)關(guān)系，表明其分布可能與土壤鹽分有關(guān)。

酸桿菌門(mén)是最近被劃分出的一門(mén)細(xì)菌，多為嗜酸菌，目前對(duì)其研究較少，但已有研究表明酸桿菌門(mén)廣泛存在于土壤中，且為優(yōu)勢(shì)菌種[10]。酸桿菌門(mén)主要分布于陸地、海洋沉積物和活性淤泥中，酸性土壤有利于其生長(zhǎng)，該研究中，酸桿菌門(mén)在光板地、重鹽土壤(獐茅土壤)中的相對(duì)豐度明顯小于其在輕鹽土壤(羅布麻土壤)中。關(guān)于酸桿菌門(mén)中的Gp7、Gp15與土壤有效磷顯著相關(guān)的原因，有待進(jìn)一步研究。

異常球菌-棲熱菌門(mén)包括一些能抵抗嚴(yán)酷環(huán)境的球狀細(xì)菌，有較強(qiáng)的耐熱、抗輻射、抗砷能力[11]。該研究只在光板地中檢測(cè)到異常球菌-棲熱菌門(mén)的出現(xiàn)，占有較大比重，且與土壤電導(dǎo)率(含鹽量)呈極顯著相關(guān)關(guān)系，這或許說(shuō)明其也有高強(qiáng)度的耐鹽性。Saccharospirillum在輕鹽土壤(羅布麻土壤)中豐度大于其他類(lèi)型土壤，今后可對(duì)其進(jìn)行深入研究，探討將其作為黃河三角洲脫鹽演化指示性細(xì)菌的可能性。

許多細(xì)菌類(lèi)群的分布并未發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的演替變化，如彎菌門(mén)和疣微菌門(mén)，呈現(xiàn)一定的隨機(jī)性，它們的分布除受土壤含鹽量影響外，可能還與土壤植被類(lèi)型以及人為影響等多種因素的共同作用有關(guān)[12]。

目前，對(duì)環(huán)境樣品16S rDNA克隆文庫(kù)的分析，通常隨機(jī)選取50～100個(gè)克隆子探討其細(xì)菌類(lèi)群和多樣性[13]。由于克隆文庫(kù)較小，不能包含樣品所有細(xì)菌的種類(lèi)，難以獲得整個(gè)細(xì)菌群落的所有信息。該研究每個(gè)克隆文庫(kù)都選取了200個(gè)克隆子，基本能夠科學(xué)反映所研究樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群和多樣性。

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Analysis of Saline Vegetation Diversity of Soil Bacterial Community in the Yellow River Delta Based on 16S rDNA Gene Library

ZHANG Yue, JANG Ai-xia, GUO Du-fa*

(College of Population, Resources and Environment, Shandong Normal University, Jinan, Shandong 250014)

[Objective]The aim of the study was to investigate the soil bacterial community structure of three kinds of saline vegetation (Bare Board, Angiospermae andA.venetum) in the Yellow River Delta, and reveal its relationship with saline vegetation succession. [Method]Phylogenetic trees were constructed by the use of bacterial 16S rDNA gene library, for each of the five libraries constructed, 200 positive clones were picked randomly and sequenced, and the data were statistically analyzed. [Result]A total of 121, 150 and 155 valid sequences were obtained from bare board, Angiospermae and A. venetum. The Angiospermae soil had the highest Shannon index and ACE index. Bacteria belonging to 8 phyla were identified, like Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria and so on. Among them, Proteobacteria accounted for 37.45%, 51.09%, 37.11% form bare board, Angiospermae andA. venetum soil, Bacteroidetes accounted for 33.02%, 3.03%, 4.47%, while the other bacterial phyla each accounted less. [Conclusion]The soil bacterial community structure of the three soil bacteria differed significantly, and Proteobacteria was the advantage microflora. The community structure of soil bacteria had significantly differences when the saline vegetation succession at the different stage.

16S rDNA; The Yellow River Delta; Bacterial community diversity; Saline vegetation

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012ZRB019DW)。

張玥(1990-)，女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物。*通訊作者。

2015-03-25

S 182

A

0517-6611(2015)13-055-03