一個抗旱/抗寒基因過表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定

韓 嬌， 陽立波， 樊婷婷， 江海坤， 張其安， 方 凌， 任永兵， 馬文佳， 曹樹青*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,安徽合肥 230009)

一個抗旱/抗寒基因過表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定

韓 嬌1， 陽立波1， 樊婷婷1， 江海坤2， 張其安2， 方 凌2， 任永兵1， 馬文佳1， 曹樹青1*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,安徽合肥 230009)

[目的]進一步研究LWT1基因在調(diào)控低溫和干旱應(yīng)答中的功能，構(gòu)建擬南芥LWT1基因過表達載體，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系。[方法]以野生型擬南芥的cDNA為模板，利用PCR擴增LWT1基因全長，將該基因連接到pART27載體上。將獲得的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株GV3101，通過浸花轉(zhuǎn)化法將LWT1重組載體轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型植株中，利用轉(zhuǎn)基因篩選與遺傳鑒定獲得LWT1轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)果]LWT1基因CDS全長990 bp，PCR電泳結(jié)果一致，測序比對結(jié)果正確。通過抗性篩選和分子鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論]LWT1過表達載體構(gòu)建成功并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系，為進一步研究該基因的分子機制奠定基礎(chǔ)。

擬南芥；LWT1基因；過表達；轉(zhuǎn)基因植株

由于植物自身的固著性，各種不良環(huán)境因素都會限制它們的生長和發(fā)育,因此植物為自身的生長發(fā)育采取一系列防御反應(yīng)來增加對外界環(huán)境的適應(yīng)能力[1]。植物面對缺水情況會通過一系列的生理分子過程來提高植物本身的耐受性[2]。通過分子和基因組分析許多干旱誘導(dǎo)基因已經(jīng)在擬南芥、水稻和其他植物中確定，其中包括一系列的調(diào)節(jié)脅迫誘導(dǎo)基因表達量的轉(zhuǎn)錄因子[3]。最近在分析參與脅迫反應(yīng)的生化和生理途徑中有重大進展，如一系列代謝反應(yīng)為了適應(yīng)干旱和高滲反應(yīng)而反生改變[4]。脅迫誘導(dǎo)基因不僅在最初脅迫反應(yīng)中起作用，而且還能增強植物的耐受能力[5]。低溫環(huán)境對植物的生長和發(fā)育具有不利影響，許多植物經(jīng)過冷馴化適應(yīng)了低溫環(huán)境，這主要是在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后水平對基因的表達進行調(diào)控可以使植物適應(yīng)低溫環(huán)境[6-7]。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是由CBF誘導(dǎo)ICE1的表達，在低溫適應(yīng)中CBF轉(zhuǎn)錄因子和非依賴CBF的調(diào)節(jié)子串聯(lián)在一起[8-9]。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)同樣能提高植物對低溫的耐受性。

合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院分子生物學(xué)實驗室在前期工作中篩選得到一個具有低溫和干旱敏感表型的突變體lwt1-1，有望通過LWT1基因的研究,揭示植物在低溫和干旱脅迫耐受過程中某些未知的調(diào)控機制。筆者通過構(gòu)建LWT1過表達材料，從而為該基因分子功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗材料。擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞野生型( Col-0 )，購買于美國擬南芥種質(zhì)資源中心，由合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院分子生物學(xué)實驗室繁衍保存。

1.1.2主要試劑。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA抽提試劑盒、TaqPCR酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ、高保真酶Phusion、T4DNA連接酶購于NEB公司,TIANGel MiDi Purification Kit、TIANquick MiDi Purification Kit、TIANprep MiniPlasmid kit購于天根公司維生素B5，Silwet L-77，蔗糖，MES，6--BA， KOH等。

1.1.3宿主菌和載體。大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1，農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株GV3101，pART27載體(帶有35S強啟動子)。

1.2 方法

1.2.1擬南芥植株的土培。①按照蛭石∶黑土∶珍珠巖=9.0∶3.0∶0.5的比例混均營養(yǎng)土。將配制好的營養(yǎng)液倒入托盤中，待營養(yǎng)液被吸收完全后，即可播種擬南芥種子。②將待播種的擬南芥種子，按照需求均勻地點播在營養(yǎng)土的表面。③待擬南芥植株長大后，等培養(yǎng)盆中的水干透后再澆水。④待種子成熟后收種，放在30 ℃烘箱中干燥15 d后于-20 ℃保存。

1.2.2LWT1過表達載體的構(gòu)建

1.2.2.1LWT1基因的獲得。①利用軟件設(shè)計所需引物，LWT1過表達載體選用KpnⅠ和XhoⅠ 2個酶切位點。所需引物：FR: 5′CGGggtaccATGTTCGCGCGAAGAC，PR: 3′CGGctcgagCCGCTTCTTCGCTTTCCTTA。②以cDNA為模板，用Pusion高保真擴增酶進行PCR擴增。

1.2.2.2LWT1基因與載體的重組。①將回收的目的基因以及pART27質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ在37 ℃下進行酶切。②用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接。③將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)中，用含有50 μg/ml壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。④挑取長勢正常的單菌落進行菌落PCR驗證，陽性菌測序保存。

1.2.3浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌菌株，用含有50 μg/ml壯觀霉素和50 μg/ml慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑取單菌落進行菌落PCR驗證，用轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌進行侵染。

轉(zhuǎn)化方法：將農(nóng)桿菌搖菌至OD600=0.8左右，5 000 r/min離心10 min，離心所得菌體用滲透緩沖液重懸，至菌液稀釋到OD600為0.8左右。將待轉(zhuǎn)化的擬南芥花苞浸于滲透液中浸泡1～3 min，黑暗中放置12 h后放在正常環(huán)境中培養(yǎng)至收種。

1.2.4轉(zhuǎn)基因陽性株系的篩選鑒定。將待篩選種子撒到含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板上培養(yǎng)14 d，植株嫩綠能長出真葉和根的作為T1代植株進行移栽。

移栽的擬南芥植株培養(yǎng)28 d后，取擬南芥葉片用CTAB法提取基因組DNA。以DNA為模板擴增LWT1基因，以此去除假陽性植株。將篩選的陽性植株所收獲的種子標(biāo)為T2。

用T1代所收種子(T2)再用潮霉素篩選鑒定分離比，選取潮霉素耐受(HygR)比對潮霉素敏感(HygS)的比例為3∶1的T2進行后續(xù)試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增擬南芥LWT1基因為了獲得LWT1基因，選取在MS培養(yǎng)基中正常生長14 d的野生型擬南芥幼苗，提取擬南芥RNA，用RT Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板擴增LWT1基因片段。結(jié)果見圖1a。由圖1a可知，LWT1目標(biāo)條帶大小與實際數(shù)據(jù)大小一致，說明成功獲得LWT1基因片段(990 bp)。同時提取pART27過表達菌株的質(zhì)粒，并進行電泳檢測，結(jié)果見圖1b。由圖1b可知，條帶大小正確，條帶清晰。

2.2 LWT1過表達載體的連接與轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ切割目的基因和pART27載體，酶切后進行電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酶切后的基因和載體條帶清晰、大小正確，可用于下一步試驗。

將酶切過的基因和載體用連接酶于16 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細胞，用含有50 μg/ml Spec的LB平板篩選陽性單克隆。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定并電泳檢測，LWT1過表達菌株的菌落PCR鑒定結(jié)果見圖3。由圖3可知，挑選的大部分單菌落都是陽性菌，擴增后條帶大小也正確。

選取部分陽性菌進行測序。根據(jù)擬南芥網(wǎng)站上提供的LWT1基因的CDS序列與返回的測序結(jié)果進行比對，比對結(jié)果為100%，說明LWT1過表達載體構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定及篩選將所收種子撒到含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板上正常培養(yǎng)14 d。一般情況下，只有轉(zhuǎn)化成功的擬南芥植株才會有潮霉素抗性，生長出正常的真葉與根。挑選生長嫩綠和長出根的幼苗進行移栽?？剐院Y選結(jié)果見圖4。

移栽的植株培養(yǎng)到21 d左右時，剪取LWT1轉(zhuǎn)基因植株葉片提取DNA，在基因組水平上檢測LWT1基因的表達水平。選取LWT1過表達載體的上下游引物從基因組水平上鑒定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，凡是轉(zhuǎn)化成功的擬南芥植株都成功擴增了LWT1基因。這說明LWT1過表達載體成功轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型植株中。

選擇陽性苗單株收種子并標(biāo)記為T2代，用含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板篩選，選擇分離比為3∶1(單插入)的T2種子，選擇對應(yīng)單插入的陽性擬南芥植株進行后續(xù)試驗。

3 討論

干旱與低溫脅迫是植物抗逆研究的重點,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為這一領(lǐng)域的研究注入了新的活力。目前同時具有抗寒和抗旱功能的基因甚少,而發(fā)現(xiàn)的LWT1基因同時具有抗寒與抗旱的功能。研究其抗寒與抗旱機制,對于農(nóng)林業(yè)的抗寒與抗旱育種研究具有重要的現(xiàn)實意義。隨著一些抗逆基因的鑒定和抗逆機理不斷深入研究，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗逆基因?qū)胫参锘蚪M，該技術(shù)在提高植物抗逆性、改良作物遺傳性狀及培育農(nóng)作物優(yōu)良品系等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。

該試驗通過遺傳學(xué)方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因過表達材料，可以用于研究LWT1基因在干旱和低溫脅迫調(diào)控過程中的生化和分子機制，為進一步研究該基因的分子機制奠定基礎(chǔ)。

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Construction and Characterization of a Drought / Cold Tolerant Gene Overexpression Lines inArabidopsis

HAN Jiao, YANG Li-bo, FAN Ting-ting, CAO Shu-qing*et al

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective] In order to further confirm thatLWT1 gene is involved in the regulation of low temperature and drought stress responses, the transgenic lines ofLWT1 overexpression were generated. [Method] The full-lengthLWT1 coding sequence was amplified through PCR from cDNA ofArabidopsisthaliana(Col-0) using specific primers and cloned into the pART27 vector. The resulting construct was transformed intoAgrobacteriumstrainGV3101 for transformation into the Col-0 plants by the floral dip method. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification. [Result] The PCR product is 990 bp which is the same as the full-lengthLWT1 CDS. The transgenic plants is gained and verified by genetic identification. [Conclusion] The vector was constructed successfully, and transgenic plants were obtained. The study will lay a foundation for further study.

Arabidopsis;LWT1 gene; Overexpression; Transgenetic lines

安徽省自然科學(xué)基金青年基金項目(1308085QC56)；安徽省科技攻關(guān)項目(1201a0301009)。

韓嬌(1989- )，女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：分子基因調(diào)控。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事植物抗逆基因克隆及應(yīng)用研究。

2015-03-25

S 188

A

0517-6611(2015)13-048-03