抗菌劑抗菌性能測定與抗菌效果評(píng)價(jià)技術(shù)研究

陳國妮，孫飛龍，閆亞茹，朱維娜

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

綜述與進(jìn)展

抗菌劑抗菌性能測定與抗菌效果評(píng)價(jià)技術(shù)研究

陳國妮，孫飛龍，閆亞茹，朱維娜

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

綜述了有機(jī)、無機(jī)、天然抗菌劑的特點(diǎn)，抗菌性能測定及評(píng)價(jià)技術(shù)，抗菌劑的展望與發(fā)展前景。詳細(xì)介紹了抗菌劑抗菌性能的各種定性和定量測試方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及體系做了全面的搜集與整理，并指出抗菌劑的研究與應(yīng)用必將成為日用品領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方向。

有機(jī)抗菌劑；無機(jī)抗菌劑；天然抗菌劑；性能測定

現(xiàn)今，在抗菌材料被廣泛利用的趨勢下，抗菌劑的研制與開發(fā)正成為新興抗菌材料添加助劑研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，因此，合理地測定和科學(xué)評(píng)價(jià)這些新型材料的抗菌性能，對(duì)于促進(jìn)抗菌產(chǎn)品市場的蓬勃發(fā)展至關(guān)重要。在抗菌劑的測試方法中，國際上最有代表性且發(fā)展較快的是日本、美國、德國等發(fā)達(dá)國家，常見的抗菌標(biāo)準(zhǔn)有AATCC（American Association of Tex-tile Chemists and Colorists）[1]、ASTME（美國材料協(xié)會(huì)抗菌標(biāo)準(zhǔn)）、JISZ（日本抗菌標(biāo)準(zhǔn)）等[2]。而我國在參考國際標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，相應(yīng)制訂了FZ/T 01021-1992《織物抗菌性能試驗(yàn)方法》[3]，GB 15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)[4]。但總體而言，在國際范圍內(nèi)對(duì)于抗菌性能測定方法與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)還沒形成一個(gè)統(tǒng)一、規(guī)范的體系，尤其在我國還存在諸多問題不明確，只是能進(jìn)行一些簡單的定性測試。

目前，由于我國對(duì)各類抗菌劑抗菌性能的測定方法與抗菌效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)還不夠全面、統(tǒng)一，進(jìn)而不能滿足國內(nèi)生產(chǎn)和對(duì)外需求，因此，本文從無機(jī)、有機(jī)、天然三方面，對(duì)國內(nèi)外現(xiàn)有的較權(quán)威的抗菌測定方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)地對(duì)比、研究與總結(jié)，以便為更多新型抗菌劑在抗菌測定方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的使用提供指導(dǎo)作用。

1 抗菌劑的分類及特點(diǎn)

抗菌劑，能夠在一定時(shí)間內(nèi)，使微生物的生長或繁殖保持在一定水平之下，可起到抑菌作用?？咕鷦┲饕譃闊o機(jī)、有機(jī)和天然三大類別，其類型與特點(diǎn)見表l。

表1 抗菌劑的類型與特點(diǎn)

2 抗菌劑的性能測定

2.1 無機(jī)系抗菌劑的抗菌性能測定

2.1.1 定性測定方法

定性測定方法主要有國外的AATCC Test Method90《Halo Test，瓊脂平皿法》、AATCC-30《抗菌劑材料抗霉菌和抗腐爛性能的評(píng)定》、JISZ 2911-1981《抗微生物性實(shí)驗(yàn)法》 以及國內(nèi)的GB/T 20944.1-2007《抗菌性能的評(píng)價(jià):瓊脂擴(kuò)散法》等[5]。定性測定方法就是簡單地在抗菌劑上接種供試菌，一段時(shí)間后觀察其生長狀況。優(yōu)點(diǎn)是成本低，耗時(shí)短；缺點(diǎn)只局限于定性測定，且測定結(jié)果也不精確。

2.1.1.1 國外定性測定法

AATCC-90測定法是根據(jù)抑菌范圍幅度來定性抗菌活性的方法。原理是用含抗菌劑的樣品緊貼已接種供試菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)后與對(duì)照組比較抑菌圈的大小。此法優(yōu)點(diǎn)處理量大，操作簡便快速，周期短；不足是無法判定供試菌液濃度，也不能定量評(píng)定抗菌活性[6]。

對(duì)AATCC-90測定法的改良有AATCC-90噴霧法和AATCC-90比色法。但是這兩種方法不適用于無琥珀酸脫氫酶的試驗(yàn)菌。

無機(jī)抗菌劑抗菌性能定性測定法還有歐洲的EN ISO 20645-2004《抗菌活性的測定 瓊脂擴(kuò)散木片試驗(yàn)》、EN ISO 20743-2007《紡織材料 抗菌成品抗菌活性的測定》、EN 14119-2003《織物檢驗(yàn) 微真菌作用的評(píng)價(jià)》等。

此外，對(duì)含抗菌劑材料抗霉菌和抗腐爛性能的評(píng)定方法有JISZ 2911抗霉菌測定法和AATCC-30測定法。JISZ 2911抗霉菌測定法是依據(jù)霉菌的長勢來判定抗菌劑的抗霉菌性能。AATCC-30是根據(jù)抗菌劑對(duì)霉菌的耐受度，來評(píng)定抗菌劑抗菌性能的有效性[7]。

2.1.1.2 國內(nèi)定性測定法

GB/T 20944.1-2007《抗菌性能的評(píng)價(jià)第1部分:瓊脂擴(kuò)散法》，是國內(nèi)制定的定性測定無機(jī)抗菌劑的一種方法。培養(yǎng)皿內(nèi)下層為無菌培養(yǎng)基，上層為接種培養(yǎng)基，加試樣培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌繁殖的程度，定性評(píng)定試樣的抗菌性能[8]。

2.1.2 半定量測定法

無機(jī)抗菌劑抗菌性能半定量測定法中應(yīng)用較多的是平行劃線法，可相對(duì)快速、方便精確地定性測試抗菌劑的抗菌性能，取代了復(fù)雜、耗時(shí)的AATCC-100。AATCC-147可半定量分析抗菌劑的抗菌性，事先用供試菌接種液在瓊脂平板培養(yǎng)皿中劃線，然后將抗菌劑試樣滴加于培養(yǎng)皿劃線處，用劃線周圍抑菌區(qū)的寬度來表征抗菌劑的抗菌能力。

2.1.3 定量測定法

定量測定的標(biāo)準(zhǔn)主要有:美國AATCCTest Method 100《菌數(shù)測定法》、ASTME 2149-2001《固著性抗菌劑抗菌性的動(dòng)態(tài)測試法》，日本JISL1902-8(1998)《定量測試法》，我國FZ/T 02021-1992《改良的奎因(Quinn)測試法》、GB/T 20944.2-2007《抗菌性能的評(píng)價(jià) 第2部分:吸收法》等。定量測定方法較定性法更加科學(xué)、準(zhǔn)確，不足是周期長、成本高。

2.1.3.1 國外定量測定法

AATCC Test Method 100測定法，能對(duì)抗菌劑的抑菌、殺菌效力進(jìn)行定量地測試。原理是將供試菌分別接種于待測樣和對(duì)照樣，離心并分離出活菌，用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測菌濃度，算出待測樣上菌的減少量[9]。該法的優(yōu)點(diǎn)是適用于大多數(shù)無機(jī)抗菌劑試樣的性能評(píng)價(jià)。缺點(diǎn)是處理量小、時(shí)間長，菌液營養(yǎng)過于豐富，實(shí)驗(yàn)條件苛刻，容器太大，不易操作[10]。

ASTME 2149-2001是一種振蕩測試法，在一定液體中接種細(xì)菌，對(duì)于含抗菌劑試樣的吸水性要求不高，對(duì)非溶出型和溶出型抗菌材料的測試都非常適用[11]。

JISL1902-8(1998)定量測定法，是日本標(biāo)準(zhǔn)制定研究中心在美國AATCC Test Method 100法的基礎(chǔ)上，對(duì)JISL1902-1990測定法加以改進(jìn)并完善，提出了JISL1902-8(1998)測定法[12]。

2.1.3.2 國內(nèi)定量測定法

FZT 01021-1992(簡稱FZ/T法)抗菌劑抗菌性能測定方法，是我國推出的定量測定標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)比待測樣菌液前后的變化，來計(jì)算菌的減少量。

改良的奎因(Quine)測定法，在含抗菌劑的待測物上滴加供試菌液，觀察比較菌落變化情況，判斷其抗菌性大小[13]。

GB/T 20944.2-2007《抗菌性能評(píng)價(jià)第2部分:吸收法》是國內(nèi)制定的一種定量測定方法。將供試菌接種于待測樣與對(duì)照樣，依次淋洗，對(duì)洗脫液中的細(xì)菌計(jì)數(shù)并算出其減少率，來評(píng)價(jià)抗菌能力[14]。

2.2 有機(jī)系抗菌劑的抗菌性能測定

2.2.1 有機(jī)抗菌劑抗菌性能評(píng)價(jià)方法

有機(jī)抗菌劑抗菌性的評(píng)價(jià)指標(biāo)有直接計(jì)數(shù)法、抑菌率和抑菌圈法。抑菌率和抑菌圈法是常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中抑菌率是定量指標(biāo)，公式R/%=(A-B)/ A×100%，R為抑菌率；A為對(duì)照樣品上的平均菌落數(shù)；B為抗菌試樣平均菌落數(shù)。

2.2.2 有機(jī)抗菌劑抗菌性能測定方法

2.2.2.1 抑菌圈法

抑菌圈法[15]是檢測有機(jī)抗菌劑抗菌性的定性方法，抑菌圈的大小可表征抗菌效果的顯著。該法是將抗菌劑涂布于特定供試菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)成立體狀擴(kuò)散，抗菌劑抑制供試菌繁殖，就會(huì)在其周圍出現(xiàn)透明圈，通過抑菌圈大小可評(píng)價(jià)抗菌劑抑菌活性大小。該方法操作簡單，但重現(xiàn)性差、準(zhǔn)確性不高。

2.2.2.2 貼膜接觸抑菌法

該法是測定有機(jī)抗菌劑抑菌性的定量方法，能夠說明有機(jī)抗菌劑的接觸抑菌機(jī)制和抗菌功能。將待測樣與對(duì)照樣溶于平板培養(yǎng)基，分別滴加供試菌液并覆蓋滅菌薄膜，培養(yǎng)一定時(shí)間后洗脫菌液，測菌濃度來評(píng)價(jià)抗菌性能。

此外還有浸漬培養(yǎng)法，適用于表面粗糙的纖維制品和樹脂成品中抗菌劑的抗菌性能測定。接觸法或包埋法，適合于抗菌材料抗菌性的進(jìn)一步探究，但不能作為定量檢測，且測定時(shí)間較長。

2.2.3 抗真(霉)菌的測試方法

2.2.3.1 接觸法

與貼膜接觸抑菌法一致，國際上ISO 846、BS1982Pt.3-90、ASTMG21-96、JISA2911-81、DIN 53793等標(biāo)準(zhǔn)都采用此方法。

2.2.3.2 暴露法

是把試樣暴露于霉菌生長的場所過后再測試樣長霉的情況。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 242316-1991、GB/T 4768-1995等采用此方法。

2.3 天然生物系抗菌的劑抗菌性能測定

生物抗菌劑抑菌活性測定方法有瓊脂擴(kuò)散法和連續(xù)稀釋法。瓊脂擴(kuò)散法包括濾紙片擴(kuò)散法、管碟法、挖溝法和打洞法，其中濾紙片擴(kuò)散法中抗菌劑在紙片上的裝載量小，管碟法和挖溝法對(duì)儀器要求較高，打洞法抗菌劑的裝載量過大，擴(kuò)散效果不容易控制，靈敏度較低[16]。一般對(duì)天然抗菌劑活性的研究建議采用靈敏度較高的管碟法或挖溝法。

2.3.1 管碟法

管碟法作為法定的生物抗菌劑檢定方法，已被各國藥典廣泛采用。管碟法就是利用有一定體積的不銹鋼制的小管（牛津杯），將生物抗菌劑溶液裝滿小杯，一定時(shí)間后，可產(chǎn)生透明抑菌圈。抑菌圈的大小衡量抗菌劑抗菌性能，將已知的抗菌劑標(biāo)準(zhǔn)液先制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較標(biāo)準(zhǔn)液與待測抗菌劑的抑菌圈大小，就可算出待測抗菌劑的抗菌性能[17]。

2.3.2 平板打洞法

將抗菌劑配成不同濃度的溶液，過濾除菌備用。在無菌條件下，在滅菌過的培養(yǎng)皿內(nèi)注入相應(yīng)菌種的固體培養(yǎng)基，制成平板，吸取供試菌懸液到培養(yǎng)平板上。用打孔器在培養(yǎng)基上打出一定直徑的孔，每孔加入適量的抗菌劑溶液，以無菌蒸餾水作空白對(duì)照?？咕鷦┤芤簲U(kuò)散，使其周圍的測試菌生長受到抑制而形成透明的抑菌圈[18]。

2.3.3 試管法

將平板打洞方法中剛剛出現(xiàn)陽性效果（有抑菌圈）的抗菌劑，在液體培養(yǎng)基中設(shè)置多個(gè)濃度梯度；取一定量各菌懸液，分別加入到含有各抗菌劑的液體培養(yǎng)基中，搖勻培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行平板的涂抹培養(yǎng)，測其最低抑菌濃度（MIC），判斷抑菌能力[19]。

此外還有梯度稀釋-活菌計(jì)數(shù)法[20]和滴下法[21]。梯度稀釋-活菌計(jì)數(shù)法是將待測樣品制成均勻的系列濃度梯度稀釋液，再分別加入到抗菌劑藥物中，一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)數(shù)，從存活的細(xì)菌數(shù)量計(jì)算出抗菌劑對(duì)試驗(yàn)菌的致死率，從而判斷抗菌劑的殺菌能力。滴下法用于具有吸水性的抗菌劑食品檢測。

3 前景與展望

本文從無機(jī)、有機(jī)、天然三方面，對(duì)目前世界上使用較多的抗菌測試方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)的對(duì)比、歸類與總結(jié)，這將對(duì)更多新型抗菌劑的研究和開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，在實(shí)驗(yàn)方法、評(píng)價(jià)方法、測試標(biāo)準(zhǔn)等的使用過程中都能給予一定的指導(dǎo)作用。

隨著人們生活水平的提高和科研技術(shù)的發(fā)展，抗菌劑在抗菌材料中的應(yīng)用技術(shù)將會(huì)更加成熟，更多新型抗菌材料會(huì)越來越受到人們的青睞，進(jìn)而在家電、日常用品、化學(xué)器件、公共設(shè)施等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用?？咕鷦┑难兄婆c開發(fā)正成為新興抗菌材料添加助劑研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

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Antibacterial Property Measurement Technology and Antibacterial Effect Evaluation

CHEN Guo-ni，SUN Fei-long，YAN Ya-ru，ZHU Wei-na
(School of Environment & Chemical Engineering, Xi’an Polytechnic University, Xi’an 710048, China)

The antibacter ial agent characteristics, antibacterial property measurement and evaluation technology, the prospect and development trend of the research on organic, inorganic and natural antibacterial agents both at home and abroad were reviewed in this paper.The various qualitative and quantitative test methods of antibacterial performance were introduced in detail.The standards and systems of the experiment and evaluation methods were collected and organized across the board.The research and application of antibacterial agent would become an important direction of development of the f eld of daily products.This study may be valuable for the research, development and application of new antibacterial agent.

organic antibacterial agent; inorganic antibacterial agent; natural antimicrobial agent; property measurement.

TQ 455

A

1671-9905(2015)02-00-

西安工程大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(BS1011)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(1238)

陳國妮( 1989-)，女，陜西人，研究生，碩士，電話:15114866196，E-mail: 240376704@qq.com

孫飛龍，副教授，博士，電話:02982330177，E-mail: sunfeilong@xpu.edu.cn

2014-11-14