免疫性不孕癥患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4的水平研究

馬興璇 孫一帆 生淑亭 韋麗麗 劉春明 張紅雨 吳玉芬 王林春 龍康

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西柳州545001；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院婦科，廣西柳州545001；3.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545001

免疫性不孕癥患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4的水平研究

馬興璇1孫一帆1生淑亭2韋麗麗2劉春明1張紅雨1吳玉芬3王林春1龍康1

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西柳州545001；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院婦科，廣西柳州545001；3.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545001

目的探討外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）與免疫性不孕的關(guān)系，為免疫性不孕的診斷和治療提供依據(jù)。方法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)60例免疫性不孕婦女（研究組）和60例正常妊娠的育齡婦女（對(duì)照組）外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果研究組外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平值分別為：（3.66±0.59）%、（2.97±0.63）%、（3.17±0.36）%，均低于對(duì)照組［（8.17±0.63）%、（7.17±0.53）%、（8.21±0.56）%］，兩組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。結(jié)論免疫性不孕癥患者外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4的表達(dá)水平比正常妊娠的育齡婦女少，CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達(dá)的降低可能是免疫性不孕的重要原因。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；免疫性不孕；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4；叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3

目前免疫性不孕的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：夫婦雙方同居一年以上，其他檢查結(jié)果均正常，而由女方血清抗精子抗體（ASAb）和（或）抗卵透明帶抗體（ZPAb）陽(yáng)性引起的不孕［1］，它是婦科的常見(jiàn)病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已婚婦女中約20%患有不孕癥，其中20%～40%屬于免疫性不孕，由于多種因素的影響，近年來(lái)發(fā)病率有上升的趨勢(shì)［2-3］。但長(zhǎng)期以來(lái)免疫性不孕的病因不明確，特別是分子和細(xì)胞水平的研究幾乎空白，評(píng)價(jià)診斷和治療效果缺乏量化的指標(biāo)。研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）與免疫性疾病密切相關(guān)，其數(shù)量和功能異常是免疫性疾病的病因之一。為了探明外周血中CD4+CD25+Treg與免疫性不孕的關(guān)系，筆者對(duì)60例免疫性不孕婦女外周血中的CD4+CD25+Treg、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）進(jìn)行了對(duì)照研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

研究組：收集2014年6～10月在廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）婦科門(mén)診就診并經(jīng)過(guò)檢查確診的免疫性不孕婦女60例，年齡24～41歲，平均（32±6）歲。對(duì)照組：收集2014年6～9月在我院婦科門(mén)診做人工流產(chǎn)術(shù)的健康育齡婦女60例，年齡16～43歲，平均（28±7）歲。研究組和對(duì)照組平均年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

1.2.1.1 主要試劑藻紅蛋白（PE）結(jié)合的CD4-PE單抗和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD25-FITC單抗、PE藻青蛋白標(biāo)記（APC）標(biāo)記的鼠抗人CTLA-4抗體、APC Foxp3單抗及配套染色試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.1.2 儀器美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur型流式細(xì)胞儀。

1.2.2 檢測(cè)方法

清晨空腹采集2 mL靜脈血，EDTA-2K抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液獲得單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL，取樣100 μL，分別加入10 μL CD4、CD25、CTLA-4、Foxp3抗體，室溫下避光10 min，加溶血素2 mL后再避光15 min，根據(jù)紅細(xì)胞的裂解狀態(tài)，以1500 r/min離心5 min，棄去上清液，加磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌1次，再加300 μL PBS液混勻，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平均低于對(duì)照組，兩組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平比較

表1 兩組外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平比較

注：CD4+CD25+Treg：CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Foxp3：叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3；CTLA-4：細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4

組別CD4+CD25+TregFoxp3CTLA-4研究組對(duì)照組t值P值3.66±0.59 8.17±0.63 3.82＜0.01 2.97±0.63 7.17±0.53 3.63＜0.01 3.17±0.36 8.21±0.56 3.46＜0.01

3 討論

與免疫性不孕相關(guān)的免疫性抗體的研究報(bào)道很多，包括ASAb、ZPAb、抗子宮內(nèi)膜抗體（EmAb）、抗心磷脂抗體（AcAb）、抗卵巢抗體（AoAb）等，但目前只有ASAb、ZPAb已通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)［4］。ASAb可從多個(gè)環(huán)節(jié)影響不孕［5-9］：①干擾精子獲能、頂體反應(yīng)及受孕：宮頸黏液中含有抗凝血酶和蛋白酶抑制劑，可抑制精子頂體酶系的活性，影響精子獲得能量。表面帶的免疫球蛋白的精子，在通過(guò)宮頸黏液時(shí)，可與黏液中受體片段結(jié)合，發(fā)揮作用，從而阻礙精卵結(jié)合。②清除女性生殖道精子：通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)，ASAb激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮對(duì)精子的吞噬作用，加速清除女性生殖道內(nèi)精子，降低精子密度，影響受精。透明帶（ZP）Ab可通過(guò)以下機(jī)制導(dǎo)致不孕［10-14］：由于ZPAb結(jié)合在ZP上，即使卵子與精子能夠結(jié)合成為受精卵，受精卵也會(huì)受到一定的損傷，因此導(dǎo)致不孕；由于ZPAb能與ZP結(jié)合，干擾不透明帶上的精子受體，使卵子與精子不能相互發(fā)現(xiàn)而結(jié)合成為受精卵；由于卵巢的損傷，使卵巢分泌與妊娠相關(guān)的激素減少，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜分泌女性激素不足或分泌減少，造成不孕；由于卵巢的在ZPAb的作用下，容易發(fā)生炎癥等，使卵泡發(fā)育不是很好或者導(dǎo)致排卵困難或不能排卵。同時(shí)ASAb和（或）ZPAb的檢測(cè)結(jié)果只能定性，不能定量，并且檢測(cè)的結(jié)果影響因素很多，特異性低，很多婦科疾病都會(huì)引起ASAb和（或）ZPAb陽(yáng)性，所以針對(duì)免疫性不孕的診斷和治療亟需尋找一個(gè)可以量化的指標(biāo)。

CD4+CD25+Treg是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，CD4+CD25+Treg的功能特點(diǎn)［15］：①CD4+CD25+Treg在體內(nèi)主要作用是發(fā)揮免疫自穩(wěn)功能，去除或減少血液中CD4+CD25+Treg，則可引發(fā)多種自身免疫性疾病，而輸入CD4+CD25+Treg則可抑制多種自身免疫性疾病發(fā)生。②CD4+CD25+Treg不但可以在胸腺內(nèi)生成，在外周也可以產(chǎn)生。如果CD4+CD25+Treg在血液中的比例或功能發(fā)生改變，容易引起多種與免疫有關(guān)的疾病。

CD4+CD25+Treg的表型標(biāo)記主要包括CTLA-4和Foxp3等。CTLA-4的主要作用是CD4+CD25+Treg在被激活后，CTLA-4可從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)而組成性表達(dá)在細(xì)胞表面，細(xì)胞表面的CTLA-4分子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Foxp3的主要作用是它的表達(dá)可使CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化為CD4+CD25+Treg，并發(fā)揮免疫抑制作用。但是Foxp3對(duì)CD4+CD25+Treg的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。由于CTLA-4和Foxp3都能在CD4+CD25+Treg上表達(dá)，所以可以通過(guò)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞中的CTLA-4和（或）Foxp3的比例和功能，從而間接了解CD4+CD25+Treg在T淋巴細(xì)胞中的比例和功能。

國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：人類妊娠蛻膜中含大量的CD4+CD25+Treg。CD4+CD25+Treg有可能在人類妊娠的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，它在T淋巴細(xì)胞中的功能和數(shù)量的失調(diào)可能將影響妊娠的結(jié)局。通過(guò)動(dòng)態(tài)跟蹤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)妊娠的過(guò)程中CD4+CD25+Treg的比例在逐漸增高，從早期妊娠到足月時(shí)蛻膜中CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞的9%～15%。根據(jù)這些細(xì)胞的特征，這些被確認(rèn)的T細(xì)胞在人類蛻膜中顯示出CD4+CD25+Treg的表型［16-18］。這些高表達(dá)的表型包括CTLA-4、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子以及Foxp3等［19］。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)：CD4+CD25+Treg在早期妊娠婦女外周血中升高，至中期妊娠達(dá)到最高峰，而產(chǎn)后數(shù)量下降，所以妊娠期間CD4+CD25+Treg是動(dòng)態(tài)變化的［20-21］，提示妊娠時(shí)全身CD4+CD25+Treg存在系統(tǒng)擴(kuò)增，并且還證實(shí)CD4+CD25+Treg的擴(kuò)增不是被同種抗原驅(qū)使的，而是被妊娠本身驅(qū)使的。妊娠時(shí)CD4+CD25+Treg絕對(duì)數(shù)量的增加預(yù)示其更強(qiáng)的免疫耐受環(huán)境，這是母胎耐受所需。Aluihare等［20］研究顯示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞募集或功能可能在不孕癥中受到損害，不孕癥可能與免疫耐受的受損相關(guān)。

筆者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：研究組外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4數(shù)量與對(duì)照組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），免疫性不孕患者外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達(dá)明顯低于能正常妊娠的育齡婦女。CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達(dá)降低可能是免疫性不孕的病因之一，通過(guò)免疫抑制劑治療，提高患者體內(nèi)的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表達(dá)可能是治療免疫性不孕的重要手段。但CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4在免疫性不孕中如何發(fā)揮作用，它的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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Research on relationship between frequency of circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 and immunological infertility

MA Xingxuan1SUN Yifan1SHENG Shuting2WEI Lili2LIU Chunming1ZHANG Hongyu1WU Yufen3WANG Linchun1LONG Kang1
1.Department of Chinical Laboratory,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China;2.Department of Gynaecology,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China;3.Department of Central Laboratory,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China

ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3, CTLA-4 and immunological infertility,and to provide the basis for the diagnosis and treatment of immunological infertility.MethodsThe levels of the circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 were detected by flow cytometry(FCM) in 60 cases of immunological infertility women(study group)and 60 cases of health gestation age women(control group), and the results were analyzed with statistics.ResultsThe levels of the CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 in peripheral blood of the study group were(3.66±0.59)%,(2.97±0.63)%,(3.17±0.36)%,which were lower than those of the control group［(8.17±0.63)%,(7.17±0.53)%,(8.21±0.56)%］,the differences between the two groups had statistical significances (allP＜0.01).ConclusionThe levels of the CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 in immunological infertility women have significantly decreased,which suggestes that the reduce of the gestation CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 may play an important role in female immunological infertility.

CD4+CD25+regulatory T cells;Immunological infertility;Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4;Foxp3

R714.21

A

1673-7210（2015）02（a）-0088-04

2014-11-10本文編輯：衛(wèi)軻）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（編號(hào)Z2014443）。