HPLC法測定婦科濕熱清顆粒中連翹苷的含量

趙文艷 朱法根 李 超

HPLC法測定婦科濕熱清顆粒中連翹苷的含量

趙文艷 朱法根 李 超

（濟川藥業(yè)集團有限公司，泰興2254 41）

目的建立H PLC法測定婦科濕熱清顆粒中連翹苷含量的方法。方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為乙腈-水（22∶78），流速1.0 m L/m in，檢測波長為277 nm，柱溫30℃。結果連翹苷在16.2μg/m l～162μg/m l濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，r=0.9999，加樣回收率為97.45%，R SD為1.36%。結論該方法操作簡便、靈敏、可靠，可用于婦科濕熱清顆粒的質量控制。

連翹苷；婦科濕熱清顆粒；高效液相色譜法

婦科濕熱清顆粒是由金銀花、連翹、薏苡仁等12味藥材制成的中藥復方制劑，具有清熱利濕之功能。用于濕熱蘊結型盆腔炎性疾病后遺癥（慢性盆腔痛）。方中連翹為君藥，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱之功效[1]。連翹有廣譜的抗菌作用，且有抗病毒、解熱抗炎和抗肝損傷多種藥理作用[2-3]；其所含的主要有效成分為連翹苷具有較強的抑菌作用[4]，并能抑制CAFP、磷酸二酯酶的活性[5]。為了提高質量標準，突出對君藥連翹的控制，本實驗建立連翹苷作為婦科濕熱清顆粒定量指標的含測方法，以便更好的控制其制劑質量。

1 儀器與試藥

Shimadzu 20A高效液相譜儀（LC-20AT泵，SPD-20A紫外-可見檢測器、CTO-10ASVP柱溫箱、SIL-20A自動進樣器）；Fettler XS205型電子分析天平。連翹苷（批號：110821-200711，供含量測定用，含量以98.9%計，中國藥品生物制品檢定所）；婦科濕熱清顆粒（批號：140715，濟川藥業(yè)集團有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（22∶78）為流動相；檢測波長為277 nm；流速：1.0 ml/min；理論板數(shù)按連翹苷峰計算應不低于3000。

2.2 對照品制備方法取連翹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含80μg的溶液，即得。

2.3 供試品制備方法取裝量差異項下的本品，研細，取約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇30 ml，超聲處理（功率200 W，頻率58 KHz）30分鐘，放冷，濾過，濾液置水浴濃縮約2 mL，加在中性氧化鋁柱（100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用70%乙醇100 mL分數(shù)次洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性實驗原處方去除連翹藥材，按制劑工藝制備得連翹的陰性制劑。按照供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，測定。

比較對照品溶液、陰性樣品溶液和供試品溶液的色譜圖（見圖1、2、3），結果顯示，陰性樣品溶液在連翹苷相應的保留時間處無吸收峰，表明陰性樣品無干擾，該方法具有專屬性。

圖1 連翹苷對照品溶液H PLC色譜圖

圖2 陰性樣品溶液H P LC色譜圖

圖3 供試品溶液H P LC色譜圖

2.5 檢測靈敏度將對照品溶液逐級稀釋，以信噪比約為10∶1，確定其定量限；以信噪比約為3∶1，確定其檢測限。當信噪比為10∶1時，連翹苷的進樣量為10.52 ng；當信噪比約為3∶1時，連翹苷的進樣量為3.16 ng。

2.6 線性關系考察精密稱取連翹苷16.38 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液一；精密量取對照品溶液一15 mL、10 mL、5 mL、2 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液二、三、四、五。分別精密吸取對照品溶液一、二、三、四、五各10μL，注入液相色譜儀，測定。以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=6805.5X+ 2420.5，r=0.9999，結果表明連翹苷在16.2μg/mL～162 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.7 對照品精密度實驗精密吸取同一連翹苷對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定，試驗結果對照品日內(nèi)精密度RSD為0.20%，日間精密度RSD為0.40%，表明該方法進樣精密度較好。

2.8 中間精密度試驗同一批樣品（批號140715），不同操作人員、不同時間、不同儀器設備，依法進行測定，試驗結果RSD為1.5%，表明中間精密度良好。

2.9 樣品穩(wěn)定性試驗精密吸取同一樣品（批號140715）供試液10ul，分別于0、2、4、6、8、12、17小時進樣，測定，試驗結果樣品穩(wěn)定性RSD為1.45%，表明供試品溶液中連翹苷在17 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復性試驗取同一樣品（批號140715）6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理，依法測定，試驗結果6份樣品測定結果RSD為0.88%，表明該方法重復性較好。

2.11 加樣回收率試驗取含量已知樣品（批號140715），進行加樣回收率試驗。取6份，每份約1.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的連翹苷對照品溶液（0.034 mg/mL），按2.3項下方法制備供試品溶液，測定（見表1）。

表1 加樣回收率試驗測定結果

試驗結果顯示，連翹苷平均加樣回收率為97.45%，RSD為1.36%，表明該方法準確度良好。

2.12 樣品含量測定取3批樣品（150101、150102、150103）依法檢測，分別為0.98、0.96、0.99（mg/袋）。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇根據(jù)連翹苷對照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)掃描結果，連翹苷在277 nm有最大吸收，確定其檢測波長為277 nm。通過流動相乙腈：水不同比例25∶75[6]、22∶78、19∶81[7]比較，其中22∶78分離度相對較好，故選擇流動相比例為乙腈-水（22∶78）。試驗中考察了不同色譜柱（Phenomenex Gemini 5μ C18 110A 250×4.6mm柱（1）、Phenomenex Gemini 5μ C18 110A 250×4.6mm柱（2）及Phenomenex Luna 5μ C18（2）100A 250×4.6mm柱）、不同儀器（Shimadzu 20A高效液相色譜儀和Agilent 1100高效液相色譜儀）的影響，試驗結果連翹苷的分離度及對稱性均良好，表明該方法系統(tǒng)耐用性均良好。

3.2 供試品溶液制備方法本制劑供試品處理方法考察了萃取法（氯仿、正丁醇）與上中性氧化鋁柱法，結果表明上中性氧化鋁柱方法雜質較少且提取含量較高，故選用上中性氧化鋁柱。同時考察了不同提取方式（加熱回流、超聲、冷浸30分鐘）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇）、不同提取時間（15 min、30 min、 45 min）、不同溶劑用量（20 mL、30 mL、40 mL）對婦科濕熱清顆粒中連翹苷提取率的影響；結果表明甲醇超聲提取連翹苷提取率較高且方法簡便可行，提取時間30 min、提取溶劑30 ml可以充分提取連翹苷。此外，還考察了氧化鋁用量（1.5 g、2 g、2.5 g）對連翹苷提取率的影響，1.5 g含量較高，但吸附不完全，峰形不好；2.5 g峰形較好，但不能完全洗脫，含量較低；2 g峰形較好，且含量較高；故選擇氧化鋁用量為2 g。最后選擇采用加入30 mL甲醇，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，濾液置水浴濃縮約2 mL，加在中性氧化鋁柱（100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用70%乙醇100 mL分數(shù)次洗脫來制備供試品溶液。以上分析方法驗證結果表明，本方法操作簡便、靈敏、可靠，適合婦科濕熱清顆粒的質量控制。

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[4]姜濤，張立偉．連翹抗菌-譜效關系研究[J]．化學研究與應用，2015，27(3): 256-261．

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[6]雷建林，李艷桃，聶會生，等．H PLC法測定不同產(chǎn)地連翹藥材中連翹苷的量[J]．中華中醫(yī)藥學刊，2012，30(1):202-203．

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中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育雜志社

2015年2月10日

ZHAO Wenyan, ZHU Fagen, Li Chao(Jumpcan Pharmaceutical Group Co. , Ltd. , Jiangsu Province, Taixing 225441, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of phillyrin in Fuke Shireqing granules.MethodsOctadecylsilane chemically bonded silica was used as bulking agent.The mobile phase was consisted of acetonitrile-water（22：78）with the flow rate of 1.0mL/min，and the detection wavelength was 277nm，with the column temperature at 30℃.ResultsPhillyrin showed a good linearity in the concentration range of 16.2μg/ml～162μg/ml，the coefficient was 0.9999，the average recovery was 97.45%，and RSD was 1.36%.ConclusionThe method is simple，sensitive and suitable，and can be used for the quality controlof Fuke Shireqing granules.

Phillyrin；Fuke Shireqing granules；HPLC

1672-2779（2015）-20-0147-03

：楊杰本文校對：李超

2015-08-25）