人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義

王 娟 李 燕 趙駿達(dá) 馬俊旗

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科生殖助孕中心婦科門診，新疆烏魯木齊830000

人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義

王 娟 李 燕 趙駿達(dá) 馬俊旗▲

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科生殖助孕中心婦科門診，新疆烏魯木齊830000

目的探討人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義。方法選取2012年10月～2014年10月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行宮頸癌篩查的患者627例，先行液基細(xì)胞學(xué)檢查，后行陰道鏡檢查并取活檢，同時(shí)行人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測和人端粒酶RNA基因檢測。分析不同病癥間臨床指標(biāo)的變異情況。結(jié)果未見上皮病變或惡性改變（NILM）、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞與不典型腺細(xì)胞（ASC-US）、不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變的的不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、腺癌（AC），人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達(dá)率分別為18.6%、42.9%、51.0%、80.6%、47.4%、5.9%、0.0%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=93.770，P＜0.01），呈先升高后降低趨勢，在LSIL達(dá)到最高點(diǎn)，在AC降至最低點(diǎn)；人端粒酶RNA基因陽性表達(dá)率分別為0.0%、19.9%、36.3%、51.6%、94.7%、100.0%、100.0%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=279.564，P＜0.01），呈持續(xù)升高趨勢，在SCC與AC達(dá)到最高點(diǎn)。依正常、炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宮頸癌順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達(dá)率分別為18.6%、46.1%、80.6%、53.3%、25.0%、3.6%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=93.015，P＜0.01），呈先升高后降低趨勢，在CINⅠ期達(dá)到最高點(diǎn)，在宮頸癌降至最低點(diǎn)；人端粒酶RNA基因陽性表達(dá)率分別為0.0%、26.4%、51.6%、93.3%、100.0%、100.0%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=269.582，P＜0.01），呈持續(xù)升高趨勢，在CINⅢ期達(dá)到最高點(diǎn)。結(jié)論人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白聯(lián)合人端粒酶RNA基因檢測，在宮頸癌前病變中具有較高的指導(dǎo)價(jià)值。

人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白；人端粒酶RNA基因；宮頸癌

宮頸癌是臨床常見病癥，也是女性特有疾病之一，在惡性腫瘤疾病中，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]，每年我國的新發(fā)病例和病死病例約為13.5萬人和5.0萬人[2]，且近年來，其發(fā)病率持續(xù)上升，嚴(yán)重影響著婦女的身體健康，也明顯影響患者的預(yù)后狀況。因而及早診斷和治療是改善患者的預(yù)后，提高患者生活質(zhì)量的有效手段。目前，臨床篩查宮頸癌的臨床指標(biāo)有多種，其中人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白是評價(jià)人乳頭狀瘤病毒感染狀態(tài)的有效指標(biāo)[3-4]。在宮頸細(xì)胞由非典型性病變向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變過程中，幾乎都伴有3號染色體長臂擴(kuò)增，且常見片段位于3q26～27，且定位于3q26.3的人端粒酶基因中，因而檢測人端粒酶RNA基因有助于篩查宮頸癌[5-6]。為探討人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的意義，本研究選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行宮頸癌篩查的患者627例，先行液基細(xì)胞學(xué)檢查，后行陰道鏡檢查并取活檢。同時(shí)行人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測和人端粒酶RNA基因檢測?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年10月～2014年10月于我院行宮頸癌篩查的女性患者627例，排除患有其他器質(zhì)性疾病、血液性疾病、免疫性疾病、精神疾病的患者。宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2011年《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS 334-2011）》，后經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。年齡21～63歲，平均（35.6±10.7）歲；體重37～74 kg，平均（43.8±11.5）kg；其中未婚婦女134例，已婚婦女493例；未妊娠婦女102例，妊娠婦女391例；妊娠婦女中，初產(chǎn)婦276例，經(jīng)產(chǎn)婦115例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

所有患者先行液基細(xì)胞學(xué)檢查，后行陰道鏡檢查并取活檢。

1.2.1 液基細(xì)胞學(xué)檢查用特制的長柄毛刷在宮頸鱗柱交界的部位行順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈，然后將刷頭置入配套保存瓶（內(nèi)含固定液）中，使用超柏氏薄層細(xì)胞檢測系統(tǒng)對標(biāo)本實(shí)施批量預(yù)處理，制片并染色，使用美國Cytye公司生產(chǎn)的Thinprep 2000液基模式薄層掃描儀進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測。

1.2.2 陰道鏡檢查并取活檢所用儀器為美國威龍公司生產(chǎn)的8900型偉花電子陰道鏡，在非月經(jīng)期窺器暴露宮頸，將宮頸表面分泌物拭凈，用浸透3%～5%冰乙酸的棉球浸潤宮頸30～60 s，在鏡下觀察轉(zhuǎn)化去的改變情況，包括顏色、血管、形態(tài)，同時(shí)觀察鱗狀上皮和柱狀上皮交界處，尋找異常陰道鏡圖像，在可疑部位取組織行活檢，這些部位包括白色上皮、點(diǎn)狀血管、鑲嵌、腺口周圍白環(huán)、異性血管、明顯突起的部位，未見可疑病變時(shí)，可在轉(zhuǎn)化區(qū)3、6、9、12點(diǎn)和宮頸管做活檢，將活檢組織放入10%福爾馬林液中固定，行石蠟包埋、切片、HE染色，由專業(yè)的閱片人員進(jìn)行檢測。

1.2.3 人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白檢測試劑盒購自于美國Advanced醫(yī)療科技有限公司，采用DNA核酸雜交與免疫組織雙重檢測，包括6、11、16、18、31、45型等在內(nèi)的28型人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測試劑盒購自于北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，采集20例正常人的宮頸細(xì)胞，使用低滲紙片法制備玻片，然后建立試驗(yàn)閾值，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，實(shí)施細(xì)胞滴片制備、預(yù)處理、變性、雜交、閱片。未見上皮病變或惡性改變（NILM）、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞與不典型腺細(xì)胞（ASCUS）、不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變的的不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ期的結(jié)果判定：細(xì)胞基因擴(kuò)增檢測值高于閾值為陽性，可認(rèn)定為存在hTERC基因異常擴(kuò)增，而檢測值低于閾值可認(rèn)定為陰性。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白的評定標(biāo)準(zhǔn)[7]人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白定位于病變細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)紅棕色，可定性為陽性，否則為陰性。

1.3.2 人端粒酶RNA基因的評定標(biāo)準(zhǔn)[8]對20例正常人員行細(xì)胞涂片，每例計(jì)數(shù)100個(gè)，記錄基因異常擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目的百分比，異常閾值=平均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果為6.4%，高于6.4%為人端粒酶RNA基因異常擴(kuò)增陽性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 液基細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標(biāo)的變異情況比較

依NILM、ASC-US、ASC-H、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、腺癌（AC）順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達(dá)率呈先升高后降低趨勢，在LSIL達(dá)到最高點(diǎn)（80.6%），在AC降至最低點(diǎn)（0.0%）。人端粒酶RNA基因陽性表達(dá)率出持續(xù)升高趨勢，在SCC與AC升至最高點(diǎn)（100.0%）。見表1。

表1 液基細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標(biāo)的變異情況比較[n（%）]

2.2 液基細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標(biāo)的變異情況比較

正常、炎癥、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宮頸癌順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達(dá)率呈先升高后降低趨勢，在CINⅠ期達(dá)到最高點(diǎn)（80.6%），在宮頸癌降至最低點(diǎn)（3.6%）。人端粒酶RNA基因陽性表達(dá)率呈持續(xù)升高趨勢，在CINⅢ期升至最高點(diǎn)（100.0%）。見表2。

表2 液基細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果中不同病癥間臨床指標(biāo)的變異情況比較[n（%）]

3 討論

宮頸癌也稱子宮頸癌，指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，是女性常見惡性腫瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且在女性各種惡性腫瘤中也是較為多見的[9-10]。發(fā)病原因目前尚不清楚，早婚、早育、多產(chǎn)及性生活紊亂的婦女有較高的患病率。宮頸癌與多種因素有關(guān)，其中關(guān)鍵因素之一就是高危型人乳頭狀瘤病毒的持續(xù)感染。

人乳頭狀瘤病毒存在多種亞型，可誘發(fā)不同組織學(xué)分型的宮頸病變，其中低危型人乳頭狀瘤病毒感染可造成良性皮膚表現(xiàn)或外生殖器疾病良性表現(xiàn)，例如疣。高危型人乳頭狀瘤病毒感染往往會(huì)造成癌的發(fā)生，很多宮頸癌患者可檢測到人乳頭狀瘤病毒16亞型或18亞型，因而認(rèn)為持續(xù)感染的高危型人乳頭狀瘤病毒致癌基因表達(dá)是宮頸癌發(fā)生的重要因素之一[11-12]。但并非所有的人乳頭狀瘤病毒感染患者會(huì)發(fā)生宮頸癌。

在不同種屬的人乳頭狀瘤病毒中，其主要的衣殼蛋白為人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白，占人乳頭狀瘤病毒表面蛋白的90%以上，這對于完整病毒顆粒的合成是具有決定性作用的，也是病毒感染細(xì)胞的主要靶位，還是機(jī)體免疫反應(yīng)攻擊人乳頭狀瘤病毒的主要靶位。當(dāng)病毒處于增值狀態(tài)時(shí)，病因基因未整合到宿主細(xì)胞上，細(xì)胞可正常分化，L1殼蛋白表達(dá)正常，能激發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)對感染細(xì)胞的識別和清除。因而在疾病發(fā)展的前期，隨著病癥的惡化，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性率會(huì)明顯增加。

當(dāng)病因基因整合到宿主細(xì)胞上，病毒處于整合狀態(tài)，細(xì)胞分化受到阻礙，L1殼蛋白無法正常表達(dá)。而L1殼蛋白缺失會(huì)讓宮頸免疫效應(yīng)減弱，同時(shí)失去了攻擊人乳頭狀瘤病毒的靶位，機(jī)體將無法識別并清除變異細(xì)胞，使得異常增值細(xì)胞得以生存，造成了疾病的進(jìn)一步惡化。此時(shí)宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞逃脫了細(xì)胞免疫系統(tǒng)的監(jiān)測和清除功能，可持續(xù)存在并進(jìn)展為癌，而此時(shí)L1殼蛋白無法合成，將顯著降低。因而認(rèn)為人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白在病因基因整合到宿主細(xì)胞以后，會(huì)出現(xiàn)顯著降低的趨勢，直到發(fā)展為癌。

端粒酶是目前較為常見的惡性腫瘤分子標(biāo)志物，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。人端粒酶RNA基因是疾病進(jìn)展的潛在分子標(biāo)志物[13-14]，其擴(kuò)增可能與高級別宮頸病變有關(guān)。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合體，是由RNA與蛋白質(zhì)組成的依賴RNA的DNA聚合酶，這是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，它能以自身攜帶的RNA為模板，然后逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，再加至染色體末端，從而維持端粒長度的穩(wěn)定性。正常情況下，體細(xì)胞和組織端粒酶是陰性的，當(dāng)其發(fā)生激活時(shí)，端粒酶可以自身RNA為模板合成端粒DNA，已補(bǔ)充細(xì)胞分裂時(shí)端粒的縮短，因而，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生無限增殖時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)永生化，最終誘發(fā)癌。端粒酶活化是宮頸癌發(fā)生的必經(jīng)之路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，需要端粒酶的參與，病癥越嚴(yán)重，人端粒酶RNA基因的陽性表達(dá)率越高。

此研究結(jié)果表明，按NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL、SCC、AC順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達(dá)率呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，在LSIL達(dá)到最高點(diǎn)（80.6%），在AC降至最低點(diǎn)（0.0%）。人端粒酶RNA基因陽性表達(dá)率呈持續(xù)升高趨勢，在SCC與AC升至最高點(diǎn)（100.0%）。依正常、炎癥、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宮頸癌順序，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白陽性表達(dá)率呈先升高后降低趨勢，在CINⅠ期達(dá)到最高點(diǎn)（80.6%），在宮頸癌降至最低點(diǎn)（3.6%）。人端粒酶RNA基因陽性表達(dá)率出持續(xù)升高趨勢，在CINⅢ期升至最高點(diǎn)（100.0%）。說明無論是液基細(xì)胞學(xué)檢查，還是陰道鏡活檢，都顯示宮頸癌發(fā)展的不同階段，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因會(huì)發(fā)生不同程度的改變，兩種結(jié)合檢測可對疾病進(jìn)行準(zhǔn)確定性。這與諸多研究的結(jié)果是相似的，陸萍等[15]研究結(jié)果顯示，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的陽性表達(dá)隨病變程度的加重而呈下降趨勢，提示其有望成為預(yù)測宮頸癌前病變程度的標(biāo)志物，對于宮頸癌前病變的篩查和預(yù)防具有重要的意義。林志新等[16]研究結(jié)果顯示，hTERC基因FISH檢測與HR-HPVHCⅡ檢測比較能更可靠地辨別宮頸病變的程度，檢測hTERC基因擴(kuò)增對判斷早期宮頸病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)可能有一定的預(yù)測意義，有望作為宮頸癌早期篩查、病情判斷和評估預(yù)后的輔助指標(biāo)之一。

綜上所述，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白聯(lián)合人端粒酶RNA基因檢測，在宮頸癌前病變中具有較高的指導(dǎo)價(jià)值。此次研究也存在一定弊端，樣本量較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大，人乳頭狀瘤病毒L1殼蛋白和人端粒酶RNA基因聯(lián)合檢測能否對所有宮頸疾病進(jìn)行準(zhǔn)確定位和定性，尚需進(jìn)一步研究。

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Significance of human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection in cervical cancer screening

WANG JuanLI YanZHAO JundaMA Junqi▲
Gynecological Clinic,Gynecological Assisted Reproductive Center,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830000,China

Objective To investigate significance of human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection in cervical cancer screening.Methods From October 2012 to October 2014,in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,627 patients given cervical cancer screening were selected.Firstly,the patients received liquid based cytology,then they received colposcopy and biopsy,at the same time,they also received human papilloma virus L1 protein detection and human telomerase RNA gene detection.The variation of clinical indicators were analyzed between different conditions.Results According to sequence of NILM,ASC-US,ASC-H,LSIL, HSIL,SCC,AC,positive expression ratio of human papilloma virus L1 protein were 18.6%,42.9%,51.0%,80.6%, 47.4%,5.9%,0.0%,the difference was statistically significant(χ2=93.770,P＜0.01),which showed increasing at first and then decreasing,it reached highest point at LSIL,and reached lowest point at AC;positive expression ratio of human telomerase RNA gene were 0.0%,19.9%,36.3%,51.6%,94.7%,100.0%,100.0%,the difference was statistically significant(χ2=279.564,P＜0.01),which showed continue increasing,it reached highest point at SCC and AC.According to sequence of normal,inflammation,CIN phaseⅠ,CIN phaseⅡ,CIN phaseⅢ,cervical cancer,positive expression ratio of human papilloma virus L1 protein were 18.6%,46.1%,80.6%,53.3%,25.0%,3.6%,the difference was statistically significant(χ2=93.015,P＜0.01),which showed increasing at first and then decreasing,it reached highest point at CIN phaseⅠ,and itreached lowest point at cervical cancer;positive expression ratio of human telomerase RNA gene were 0.0%,26.4%,51.6%,93.3%,100.0%,100.0%,the difference was statistically significant (χ2=269.582,P＜0.01),which showed continue increasing,it reached highest point at CIN phaseⅡ.Conclusion Human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection has higher guiding value in cervical precancerous lesions.

Human papilloma virus L1 protein;Human telomerase RNA gene;Cervical cancer

R737.33

A

1673-7210（2015）06（b）-0060-04

2015-02-10本文編輯：蘇暢）

王娟（1982.11-），女，碩士研究生；研究方向：宮頸病變的診療。

▲通訊作者