環(huán)氧合酶-2、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子C在胃癌中的表達(dá)及意義

屈海燕 喬 文

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，陜西西安710061；2.陜西省榆林市中醫(yī)院消化科，陜西榆林719000

環(huán)氧合酶-2、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子C在胃癌中的表達(dá)及意義

屈海燕12喬 文1

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，陜西西安710061；2.陜西省榆林市中醫(yī)院消化科，陜西榆林719000

目的探討環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化SP法檢測COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在70例胃癌標(biāo)本和30例正常胃黏膜中的表達(dá)情況。結(jié)果COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕黃色表達(dá)，表達(dá)率分別為71.4%、62.9%、55.7%，在正常胃黏膜中的表達(dá)率為13.3%、6.7%、16.7%。不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小的COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移的COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同病理分級的COX-2蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而VEGF與VEGF-C蛋白的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。COX-2與VEGF、VEGF-C蛋白，VEGF與VEGF-C蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，COX-2的表達(dá)與VEGF、VEGF-C的表達(dá)相關(guān)，COX-2可能通過調(diào)節(jié)VEGF、VEGF-C蛋白的表達(dá)從而調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

胃癌曰環(huán)氧合酶-2曰血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子曰血管內(nèi)皮生長因子C曰免疫組織化學(xué)

胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤。國際流行病學(xué)資料顯示[1]，20世紀(jì)50～90年代，全球胃癌的發(fā)生率及死亡率呈現(xiàn)平穩(wěn)降低的總態(tài)勢，但受人口老齡化、城市化及工業(yè)化等諸多因素影響，世界范圍內(nèi)每年新病例的絕對數(shù)量是增加的。然而近年來，進(jìn)行我國惡性腫瘤死亡率的國際化比較發(fā)現(xiàn)，我國胃癌世界標(biāo)化死亡率男性為30.8/10萬，女性為13.8/10萬，均高于世界、發(fā)達(dá)及發(fā)展中國家的平均水平，且粗死亡率表現(xiàn)出年齡結(jié)構(gòu)性上升、年齡別死亡率推后等趨勢[2]。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化SP染色法檢測環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）蛋白在70例胃癌標(biāo)本和30例正常胃黏膜中的表達(dá)情況，并結(jié)合年齡、性別、腫瘤部位、病理分級、臨床分期進(jìn)一步探討3種蛋白間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集陜西省榆林市中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科2013～2014年的胃鏡活檢及手術(shù)胃癌標(biāo)本70例和30例癌旁正常胃組織。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色由我院病理科醫(yī)師診斷。胃癌標(biāo)本男42例，女28例，按WHO病理分級：高-中分化40例，低分化30例；按UICC標(biāo)準(zhǔn)行TNM標(biāo)準(zhǔn)臨床分期：Ⅰ+Ⅱ級41例，Ⅲ+Ⅳ級29例。

1.2 試劑及檢測方法

濃縮型兔抗人COX-2及VEGF、VEGF-C即用型多克隆抗體和S-P試劑盒均購于北京中杉生物科技有限公司；DAB底物顯色劑購于武漢博士德生物科技有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。抗原修復(fù)采用枸櫞酸鈉緩沖液高壓熱修復(fù)。COX-2與VEGF多克隆抗體使用1∶100稀釋，VEGF-C多克隆抗體使用1∶150稀釋。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

COX-2及VEGF、VEGF-C 3種蛋白均以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照。免疫組化結(jié)果判定如下：陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)0～10%為陰性；＞10%～25%為弱陽性；＞25%～75%為中等陽性；＞75%為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，COX-2及VEGF、VEGF-C在胃癌及正常黏膜中的表達(dá)和胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；COX-2與VEGF、VEGF-C之間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2及VEGF堯VEGF-C蛋白的表達(dá)情況

COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌中陽性表達(dá)率為71.4%（50/70）、62.9%（44/70）、55.7%（39/70），而在正常胃黏膜中陽性表達(dá)率為13.3%（4/30）、6.7%（2/30）、16.7%（5/30）。經(jīng)比較，胃癌與正常胃黏膜之間COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.542、26.693、12.995，P＜0.01）。胃癌組織COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)在年齡、性別、不同腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小分組上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期分組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在病理分級上COX-2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＞0.05），VEGF與VEGF-C表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1（封三）、表1。

表1 胃癌COX-2、VEGF、VEGF-C的表達(dá)與一般臨床病理特征的關(guān)系

2.2胃癌組織中COX-2及VEGF堯VEGF-C蛋白表達(dá)間的相關(guān)性分析

對70例胃癌組織中COX-2及VEGF、VEGF-C三種蛋白進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析顯示，COX-2與VEGF-C蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.747，P＜0.05）；COX-2與VEGF蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.539，P＜0.05）；VEGF與VEGF-C蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.082，P＜0.05）。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素進(jìn)行性發(fā)展的過程。生理狀態(tài)下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間保持著動(dòng)態(tài)平衡。這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些生長因子類物質(zhì)的共同調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素（PGs）和血栓烷的關(guān)鍵酶。COX-2為誘導(dǎo)酶，在大多數(shù)的正常細(xì)胞中是不存在COX-2的，但在一些腫瘤促進(jìn)因子、炎癥細(xì)胞因子、癌基因和生長因子迅速誘導(dǎo)下形成過量PGs，致使紅腫、發(fā)熱和疼痛等現(xiàn)象的發(fā)生。另有研究報(bào)道，COX-2還參與了動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性腸病和消化性潰瘍的炎性反應(yīng)。在胃癌漫長的發(fā)生過程中，有效發(fā)病途徑為慢性胃炎-多灶性萎縮-腸上皮化生-不典型增生-浸潤性癌[4]。研究表明，COX-2在結(jié)腸癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、鱗狀上皮癌變[8]等多種腫瘤組織中均高表達(dá)，其致癌機(jī)制有以下幾方面[9]：①通過PGs途徑抑制免疫細(xì)胞的活性，減少免疫蛋白的生成，從而抑制抗腫瘤免疫的發(fā)生。②COX-2上調(diào)表皮生長因子的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。③通過合成花生四烯酸，上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。④COX-2自身的過氧化物酶活性作用，與其上調(diào)MMP-2、MMP-1蛋白聯(lián)合作用，使腫瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。另有研究報(bào)道，COX-2還參與了消化性潰瘍、炎癥性腸病[10]和動(dòng)脈粥樣硬化[11]的炎性反應(yīng)。在本研究中，胃癌中的COX-2陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜，并在有無淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明COX-2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是胃癌轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。

胃癌的生長和轉(zhuǎn)移離不開腫瘤血管的生長，VEGF在結(jié)腸癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多種組織中高表達(dá)。研究表明，大多數(shù)癌前病變沒有大量新生血管的形成，與腫瘤組織相反，說明癌前病變進(jìn)展到腫瘤，其大量新生血管形成是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。VEGF是特異性的最強(qiáng)的血管內(nèi)皮刺激因子，其與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體結(jié)合后，產(chǎn)生促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的作用，還可以增加血管的通透性，并且在血管通透性方面促進(jìn)血管內(nèi)物質(zhì)滲出到血管外，為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與浸潤提供了良好的條件[15]。有研究表明，血清中VEGF（S-VEGF）水平在多種癌癥患者體內(nèi)的水平較正常人高，其在一定程度上可以判斷腫瘤的預(yù)后[16]。VEGF-C是VEGF家族成員之一，不僅與只存在淋巴內(nèi)皮上受體VEGFR-3結(jié)合，促進(jìn)淋巴管生成，還與受體VEGFR-2結(jié)合，抑制凋亡并增加血管通透性，并協(xié)同VEGF促進(jìn)血管的生成[17]。VEGF-C與其受體VEGFR-3結(jié)合使VEGFR-3發(fā)生自磷酸化后，誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮增殖的途徑主要有三方面：①激活MAPK和Akt信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18]；②激活PI3K/ Akt信號途徑誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮增殖并抑制凋亡[19]；③通過磷酸化Tyrl337位點(diǎn)的Shc和Grb2蛋白，激活PLC-γ/PKC通路促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮增殖[20]。本研究結(jié)果顯示，VEGF與VEGF-C的表達(dá)率均高于正常胃黏膜，并都在臨床病理特征中病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示VEGF與VEGF-C是胃癌血管、淋巴轉(zhuǎn)移的重要原因，其水平的檢測對評估腫瘤的侵襲有意義。

COX-2、VEGF共同擁有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子Tcf-4結(jié)合位點(diǎn)，可能均受β-catenin蛋白的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2生成前列腺素E2（PGE2）致β-catenin蛋白上調(diào)，通過激活Wnt/β-catenin通路使VEGF表達(dá)升高，并且VEGF可以通過延長COX-2 mRNA的活性時(shí)間使COX-2的表達(dá)上調(diào)[21]。同時(shí)，COX-2也是VEGF-C處于轉(zhuǎn)錄水平的一個(gè)重要的上游調(diào)控基因[22]。通過COX-2催化產(chǎn)物前列腺素2（PE2）與前列腺素受體EP1結(jié)合使HER-2/Neu受體磷酸化，通過MAPK/P38通路激活NF-κB，導(dǎo)致VEGF-C基因蛋白的上調(diào)[23]。有學(xué)者研究認(rèn)為，VEGF-C通過與VEGFR-2結(jié)合，可以使VEGF表達(dá)上調(diào)，而Maspin蛋白表達(dá)下調(diào)可能與VEGF、VEGF-C蛋白的上調(diào)有關(guān)[24]。本研究結(jié)果顯示，COX-2與VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，VEGF與VEGF-C蛋白表達(dá)之間也存在正相關(guān)，提示3種蛋白相互作用，協(xié)同促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)檢測COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)水平，在腫瘤的形成、發(fā)展及早期應(yīng)用基因靶向治療方面具有積極意義。

綜上所述，COX-2、VEGF、VEGF-C都具有促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展的作用，COX-2、VEGF、VEGF-C的復(fù)雜交互作用在惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要的作用。胃癌組織中COX-2的表達(dá)水平上調(diào)，影響VEGF、VEGF-C的表達(dá)，并協(xié)同胃癌發(fā)展。3個(gè)因子共同檢測可作為臨床判斷腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移潛能的參考指標(biāo)。

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Expression and significance of COX-2,VEGF and VEGF-C in gastric cancer

QU Haiyan1，2QIAO Wen1
1.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Medical College of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an710061,China;2.Department of Gastroenterology,Hospital of Traditional Chinese Medicine in Yulin City,Shaanxi Province,Yulin719000,China

Objective To study the protein expression and significance of cyclooxygenase-2(COX-2),vascular endothelial growth factor(VEGF)and vascular endothelial growth factor C(VEGF-C)in gastric cancer.Methods The expression levels of COX-2,VEGF and VEGF-C were detected by using immunohistochemical SP method in 70 cases of gastric cancer and 30 cases of normal gastric mucosa.Results The positive expression rates of COX-2,VEGF and VEGF-C in gastric cancer were 71.4%,62.9%and 55.7%;and were 13.3%,6.7%and 16.7%in normal gastric mucosa.There were no statistical significant differences in positive expression rates of COX-2,VEGF and VEGF-C among patients with different age,sex,tumor site and size(P＞0.05).There were statistical significant differences among patients with different TNM stages and lymph nodes(P＜0.05).There were no statistical significant difference in positive expression rate of COX-2 among patients with different pathological grading(P＞0.05);while there were statistical significant differences in VEGF and VEGF-C(P＜0.05).There were positive correlation between the expression of COX-2 and VEGF, VEGF-C;VEGF and VEGF-C in gastric cancer(P＜0.05).Conclusion There are over-expressions of COX-2,VEGF and VEGF-C in gastric cancer tissues.The expression of COX-2 and VEGF,VEGF-C is correlated.COX-2 may regulate the gastric cancer occurrence and progress through regulating the protein expression of VEGF and VEGF-C.

Gastric cancer;COX-2;VEGF;VEGF-C;Immunohistochemistry

R734

A

1673-7210（2015）06（b）-0016-04

2015-01-30本文編輯：程銘）

喬文（1967-），女，漢族，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師；研究方向：胃癌的基礎(chǔ)與臨床。