產(chǎn)油微藻的篩選及其產(chǎn)油性能評價的研究

王玉榮, 師文靜, 佟明友

產(chǎn)油微藻的篩選及其產(chǎn)油性能評價的研究

王玉榮1，2, 師文靜2, 佟明友2

（1. 遼寧石油化工大學(xué)，遼寧 撫順 113001； 2. 中國石化撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

為了篩選具有產(chǎn)油潛力的能源微藻，從東北地區(qū)部分水域中分離出98種微藻。根據(jù)生長情況和尼羅紅染色法篩選出14個藻種進(jìn)行產(chǎn)油水平比較。通過藻種生物量以及油脂含量的測定，建立了富油微藻的綜合評價方法，獲得總脂含量超過30%的微藻10株，其中小球藻R1的油脂含量47.87%，油脂產(chǎn)率達(dá)到72.47 mg?L-1?d-1，并且其三?；视秃枯^高，適合于生物柴油生產(chǎn)，是具有產(chǎn)業(yè)化潛力的優(yōu)良藻種。

生物柴油; 產(chǎn)油微藻; 生物量; 油脂產(chǎn)率

為實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，可再生、無污染的生物質(zhì)能源已成為研究熱點(diǎn)[1]。生物柴油是一種重要的可再生能源[2]，但生產(chǎn)原料來源一直是限制其產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。微藻因其資源豐富、生長迅速、油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)，成為生產(chǎn)生物柴油的理想原料[3,4]。但要發(fā)展能源微藻，進(jìn)行含油微藻規(guī)?；a(chǎn)，還面臨許多技術(shù)問題，優(yōu)良藻種的獲得就是瓶頸之一。

很多微藻都含豐富的油脂,但不同微藻油脂含量有明顯差異[5]。因此，篩選高產(chǎn)油微藻是產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵[6]。國內(nèi)外研究者對能源微藻的篩選和評價做了很多工作[7，8]。本研究從東北地區(qū)的部分自然水體中分離出微藻藻種，利用尼羅紅染色法篩選出多株高產(chǎn)油微藻，對其生長速率、生物量和油脂含量進(jìn)行分析評價，旨在獲得生長速度快、生物量高、油脂含量高的優(yōu)良藻種，為微藻生物柴油提供原料來源。

1 試驗(yàn)部分

產(chǎn)油微藻的篩選評價過程如圖1所示。首先通過東北地區(qū)的部分水樣采集得到各種微藻，分離、純化；然后用染色法和顯微檢測進(jìn)行初篩；再根據(jù)生物量和油脂產(chǎn)量兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，其中生長速率和油脂含量是兩個重要指標(biāo)。生長速率指在單位時間和單位體積內(nèi)生物量的積累量；油脂含量主要是指能做為生物柴油原料油脂的含量。最后，選取生長速率快、油脂含量高的藻種分類保藏。具體方法如下：

1.1 藻種的分離與純化

藻種水樣采自東北地區(qū)部分水域，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行平板劃線法分離、純化：吸取少量稀釋的水樣接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)2～3周，用接種環(huán)挑出單藻落，在大口三角瓶中純化培養(yǎng)，3～4周后鏡檢，重復(fù)數(shù)次，直到獲得純的目標(biāo)藻株。本研究共分離出98株藻種。將分離的藻種用50 mL大口三角瓶培養(yǎng)3個月左右，選擇生長良好、易培養(yǎng)的52種藻株做下一步篩選。

1.2 微藻的尼羅紅染色

小試管中取1 mL藻液，添加0.01 mL尼羅紅染色液（以丙酮為溶劑配制成0.1 g/L），震蕩混勻，于20 ℃避光染色10 min，用倒置熒光顯微鏡（藍(lán)光激發(fā)）觀察藻細(xì)胞內(nèi)被染色油脂，確保油脂著色。然后用分光光度計(jì)測藻液的OD689.5值，用培養(yǎng)液將藻液稀釋，使藻液的OD689.5值統(tǒng)一為5左右，再取1 mL的藻液于48孔熒光板，每孔再加入10 μL尼羅紅染色液，用酶標(biāo)儀檢測530 nm光激發(fā)下，580 nm處的熒光強(qiáng)度，并扣除未染色藻液在該波長處的熒光強(qiáng)度即為凈熒光值，重復(fù)測定三次。

1.3 篩選評價實(shí)驗(yàn)

首先將用尼羅紅染色初篩選出的藻種移至1 L三角瓶（500 mL藻液）擴(kuò)大培養(yǎng)，置水平搖床培養(yǎng)3～5 d，收集藻細(xì)胞，最后用新鮮培養(yǎng)基在微藻培養(yǎng)裝置中接種。將藻種的初始濃度統(tǒng)一為OD689=0.1。培養(yǎng)周期為12 d，每兩天測一次OD值，檢測藻種生長速率，收集第12 d的藻液，10 000 r/min離心5 min收集藻細(xì)胞，凍干后測定生物量和油脂含量。

微藻分離純化與篩選評價試驗(yàn)均采用BG-11培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光暗時間比12:12，光照強(qiáng)度200μmol/（m2·s）。篩選評價實(shí)驗(yàn)使用內(nèi)徑3.6 cm，高34cm的柱狀光生物反應(yīng)器（裝液量為200 mL）培養(yǎng)。篩選評價實(shí)驗(yàn)持續(xù)通入壓縮空氣（1% CO2）。

1.4 分析方法

1.4.1 藻種比生長速率測定

比生長速率 = (lnN2- lnN1)/（T2-T1）

N1為接種時OD值，N2為培養(yǎng)結(jié)束時的OD值，T1和T2分別是培養(yǎng)開始和結(jié)束的時間。

1.4.2 生物量測定

將培養(yǎng)的藻液10 000 r/min離心5 min得到藻泥，-50 ℃下冷凍干燥至恒重，稱重得到藻細(xì)胞干重。

1.4.3 油脂含量測定方法

用乙酸乙酯/正己烷混合溶劑萃取法對藻粉的總脂含量進(jìn)行測定[9,10]

1.4.4 油脂產(chǎn)率計(jì)算

油脂產(chǎn)率 = 生物量×油脂含量/培養(yǎng)天數(shù)

1.5 薄層層析

利用氯仿/甲醇提取藻細(xì)胞中的油脂[11]，然后進(jìn)行微藻總脂的薄層層析[12,13]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 藻株的分離純化及初步鑒定

從采集的水樣中分離純化出98株藻種，其來源和細(xì)胞形態(tài)特征見表1。根據(jù)微藻的細(xì)胞形態(tài)及其生長特征，參照《中國淡水藻類—系統(tǒng)、分類及生態(tài)》，可以將部分微藻初步歸入小球藻、柵藻、桿藻等屬，要準(zhǔn)確分類到種，還需要用分子生物學(xué)手段確定。

表1 部分藻種來源及特征Table 1 Sources and characteristics of part of algae species

從表1可知，分離出的藻種細(xì)胞形態(tài)均不一樣，有圓形、桿狀、月牙形、半月形、紡錘形、梭形、葡萄狀等各種形態(tài)。柵藻細(xì)胞一般以群體形態(tài)存在，小球藻以單細(xì)胞狀態(tài)存在。

2.2 藻株的尼羅紅染色篩選

從98種藻種中篩選出生長快、不貼壁、不結(jié)團(tuán)、易培養(yǎng)的藻種52株，對其進(jìn)行尼羅紅染色篩選。有研究表明，激發(fā)波長和散射波長分別為450～500 nm和大于528 nm時，經(jīng)尼羅紅染色的微藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)中性油脂的含量顯著相關(guān)[14-17]。熒光強(qiáng)度越高則微藻油脂含量越高，因此，可通過即時測定熒光強(qiáng)度小來檢測微藻的油脂含量。

表2是52種藻株的凈熒光染色值，其中凈熒光值較高的有12種，分別是N2、R1、N-2-1、HH1、HH2、HH4、W1、W2、W3、W4、W5、JLT-B1。從表2得知，不同藻種的尼羅紅染色凈熒光值不一樣。藻株HH2的凈熒光值達(dá)到135.23，而JH-1的凈熒光值只有0.39，說明不同藻種的中性油脂含量差異很大。柵藻熒光值偏低，這與Luisa Gouveia[18]等報道的柵藻在自養(yǎng)條件下油脂含量較低相對應(yīng)；而在篩選到的球藻中，多數(shù)有較高的熒光值，與文獻(xiàn)[19,20]報道的球藻有較高的含油量相吻合。

2.3 微藻生長速率、生物量和油脂含量的測定

選出N2、R1、N-2-1等12種熒光值較高的藻種和2種生長速率較高的藻種ABH-B3、JH-D4進(jìn)行藻種評價試驗(yàn)。表3 是藻種的生長速率、生物量和油脂含量的評價結(jié)果。比生長速率最高的是ABH-B3，達(dá)到0.5982d-1，其次是HH4、W2、JLT-B1、R1和HC-D4，都大于0.5 d-1。比生長速率較高的生物量也較高，因此藻種ABH-B3的生物量也高，達(dá)到2.32 g/L。藻種HH4、W2、JLT-B1、R1和HC-D4的生物量也都高于1 g/L。

表2 尼羅紅染色藻種及凈熒光值Table 2 Nile red fluorescence of microalgae strains

2.4 微藻藻種的產(chǎn)油潛力評價

油脂產(chǎn)率是微藻總脂含量與生物量的乘積再除于培養(yǎng)天數(shù)，表示每天實(shí)際收獲的油脂量。它是反映微藻生長速率、生物量與總脂含量的綜合產(chǎn)考指標(biāo)。圖1為14種微藻的油脂產(chǎn)率圖。其中R1的油脂產(chǎn)率最高，為72.47 mg?L-1?d-1。ABH-B3與HH4也有較高的油脂產(chǎn)率，分別為56.567 mg?L-1?d-1、42.03 mg?L-1?d-1。

圖1 微藻的油脂產(chǎn)率比較Fig.1 Comparison of microalgae oil yield

2.5 微藻中三?；视秃康臏y定

微藻細(xì)胞內(nèi)儲存物三?；视椭械闹舅岽蠖酁轱柡椭舅?是生產(chǎn)生物柴油所用原料的主要成分[21]。通過薄層層析可檢測微藻中的三?；视秃俊Ｔ摲椒ň哂胁僮鞣奖恪⒖焖贆z測、分離效果好等特點(diǎn)[22]。本研究將14種微藻培養(yǎng)至穩(wěn)定期，以相同生物量提取油脂，通過薄層層析比較，篩選出三?；视秃枯^高的藻種是R1、W2、W4、HH4和ABH-B3。

表3 藻種的生長速率、生物量和油脂含量Table 3 The growth rate,biomass and oil content of microalgae strains

3 結(jié) 論

從東北地區(qū)部分水域中分離出98種微藻，選出其中14種微藻進(jìn)行產(chǎn)油水平評價，獲得總脂含量超過30%的微藻有10株，其中藻株Y1的油脂含量47.87%，油脂產(chǎn)率達(dá)到72.47 mg?L-1?d-1，并且其三酰基甘油含量較高，是適于生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)良藻種。

本研究利用快速篩選富油微藻的尼羅紅染色法、是一種很好的初級篩選方法。通過藻種比生長速率、生物量以及油脂含量的測定，建立了優(yōu)良藻種的綜合評價方法

為了使篩選的藻種適合于生產(chǎn)生物柴油，對油脂中的三?；视瓦M(jìn)行薄層層析，結(jié)合油脂產(chǎn)率，確定小球藻R1是有產(chǎn)業(yè)化潛力的優(yōu)良藻種。

［1］梁穎，馮俊麗，徐方嬌，等．一株產(chǎn)油微藻—小球藻的純化鑒定與培養(yǎng)基的篩選[J]．科技通報，2013，29（3）：40-46．

［2］孫漫，聶娟，袁維道，等．產(chǎn)油脂海洋微藻的篩選、鑒定及Fe3+對其生長和油脂積累的影響[J]．中國油脂，2012，37 （12）：70-73．

［3］Li Y, Horsman M, Wu N, et al. Biofuels from microalgae[J]. Biotechnology Progress, 2008, 24(4): 815–820．

［4］張玉璽，馬紅軍．藻類生物燃料的發(fā)展與環(huán)境保護(hù)[J]．當(dāng)代化工，2013，42（12）：1711-1714.

［5］張英偉，劉煒．微藻能源的研究進(jìn)展[J]．海洋科學(xué)，2012，36（1）:132-138．

［6］Griffiths M J, Susan T L, Harrison. Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production[J]. Journal of Applied Phycology, 2009, 21: 493–507．

［7］李濤，李愛芬，桑敏，等．富油能源微藻的篩選及產(chǎn)油性能評價[J]．中國生物工程雜志，2011，31（4）：98-105.

［8］Bai A, Jobbagy P, Durko E. Algae production for energy and foddering[J]. Biomass Conversion and Biorefinery, 2011, 1: 163–171．

［9］張桂艷，溫小斌，梁芳，等．重要理化因子對小球藻生長和油脂產(chǎn)量的影響[J]．生態(tài)學(xué)報，2011，31 ( 8) :2076－2085．

［10］溫小斌，江麗麗，耿亞洪．微藻總脂定量分析方法的比較研究[J]．中國油脂，2012，37（11）：80-85．

［11］徐 進(jìn)，徐旭東，方仙桃，等．高產(chǎn)油小球藻的篩選及其油脂分析[J]．水生生物學(xué)報，2012 ，36( 3)：426-432．

［12］Reiser S , Somerville C. Isolation of mutants of Acinetobactercal -coaceticus deficient in wax ester synthesis and complementation of one mutation with a gene encoding a fatty acyl-coenzyme A reductase[J]. Journal Bacteriology, 1997,179(9): 2969-2975.

［13］Yu E T, Zendejas F J, Lane D P, et al. Triacylglycerol accumulation and profiling in the model diatoms Thalassiosira pseudonana and Phaeodactylum tricornutum (Baccilariophyceae) during starvation[J]. Journal Applied Phycology,2009, 21(6): 669-681.

［14］周文俊，鄭立，韓笑天，等．基于尼羅紅染色分析金藻總脂動態(tài)積累[J]．水生生物學(xué)報，2014，38（2）：312-319．

［15］楊勛，劉平懷，郝宗娣，等．富油微藻Monoraphidium sp．的分離及其油脂提取工藝研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39( 32) ：19988－19990．

［16］胡小文，馬帥，弓淑芬，等．熒光光譜檢測微藻中油脂[J]．中國油脂，2011，36（4）:70-73．

［17］王海英，符茹，黃寶祥．基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質(zhì)快速檢測方法研究[J]．中國油脂，2012.37（3）：78-81．

［18］Luisa Gouveia, Ana Cristina Oliveira. Microalgae as a raw material for biofuels production[J]．Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36（2）: 269–274.

［19］王金娜，嚴(yán)小軍，周成旭，等．產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測[J]．生物物理學(xué)報，2010，26（6）：472-480．

［20］萬文文，岳燕燕，梁科鵬．兩株地下海水微藻的分子鑒定及其油脂分析[J]．海洋環(huán)境科學(xué)，2013，32（3）：440-443．

［21］李秀波，徐旭東，孔任秋．五種微綠球藻產(chǎn)油和產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究[J]．水生生物學(xué)報，2010，34（5）：893-897．

［22］黃瀟雅，陳鍇，嚴(yán)小平．泔水油的薄層層析法快速鑒別研究[J]．杭州化工，2013，43（3）：19-26．

Study on Screening of Oleaginous Microalgae and Evaluation of Its Oil-producing Performance

WANG Yu-rong1,2,SHI Wen-jing2,TONG Ming-you2
(1. Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001, China；2. Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals , SINOPEC, Liaoning Fushun 113001, China)

In order to screen microalgae that has the potential of oil production，98 strains of microalgae were isolated and purified from the water samples which were collected from the natural water in parts of northeast region. According to the growth characteristics of microalgal cultures and Nile red staining，lipid production capacities of fourteen strains of microalgae were compared. The comprehensive evaluation method of oleaginous microalgae was established by measuring biomass，total lipid content and total lipid yield. The results show that the total lipid contents of ten microalgae are more than 30 percent. It’s concluded that the most potential for industrial application is Chlorella Sp Y1,whose total lipid content and lipid productivity are 47.87% and 72.47 mg / ( L·d) respectively．R1 has high content of Triglycerides for biodiesel production.

Biodiesel; Oleaginous microalgae; Biomass; Lipid productivity

TK 6；S 216.2

： A

： 1671-0460（2015）04-0680-04

中國石化集團(tuán)微藻生物柴油成套技術(shù)開發(fā)，項(xiàng)目號：210080

2015-02-16

王玉榮（1989-），女，內(nèi)蒙人，碩士研究生，從事微藻生物資源研究。E-mail：qimuge1989@163.com。

師文靜（1980-），女，陜西渭南人，從事生物質(zhì)能源研究。E-mail:shiwenjing @163.com。