兩株尖孢鐮刀菌菌株產(chǎn)色素條件的研究

肖姬玲，沈?qū)毭?2，謝丙炎，楊宇紅

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙410128）

兩株尖孢鐮刀菌菌株產(chǎn)色素條件的研究

肖姬玲1，沈?qū)毭?,2，謝丙炎1，楊宇紅1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙410128）

鐮刀菌屬真菌能產(chǎn)生多種色素，色素功能具有多樣性。為充分挖掘鐮刀菌屬的色素資源，研究了溫度、光照條件和培養(yǎng)基p H值3種因素對(duì)非致病尖孢鐮刀菌1262菌株和尖孢鐮刀菌粘團(tuán)?；?號(hào)生理小種Fo c-a m菌株產(chǎn)色素的影響。結(jié)果顯示，在p H＜7的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，1262菌株可產(chǎn)生紫紅色色素，在p H＞7的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，1262菌株產(chǎn)生少量或者不產(chǎn)生色素。培養(yǎng)溫度和光照條件對(duì)1262菌株色素的產(chǎn)生影響不大；尖孢鐮刀菌甘藍(lán)專化型菌株Fo c-a m，黑暗條件下不產(chǎn)生色素，光照下可產(chǎn)生橙色色素，而培養(yǎng)基的p H值和溫度對(duì)其色素的產(chǎn)生影響不大。結(jié)果說明，尖孢鐮刀菌的不同種產(chǎn)色素條件有差異，改變培養(yǎng)條件可使不產(chǎn)色素的鐮刀菌產(chǎn)生色素，這為尋找新的色素提供了思路。

尖孢鐮刀菌；菌株；色素；溫度

真菌色素是一類重要的化合物，其種類繁多，顏色多樣，與合成色素相比，具有安全性高、無副作用、色調(diào)自然和接近天然物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，且具有不受資源環(huán)境和空間限制的優(yōu)越性。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，有些色素，如蒽醌類色素，還具有止瀉和抗菌、抗癌、抗病毒等功效[1]。因此越來越多的研究者致力于真菌色素的研究。

鐮刀菌屬于半知菌亞門，絲孢綱，瘤座孢目，瘤座孢科，鐮刀菌屬。該屬中包括的多種鐮刀菌都能產(chǎn)生色素，且色素顏色各異，因此該屬包含豐富的色素資源。如腐皮鐮刀菌（FusariuMsolani）暗培養(yǎng)呈現(xiàn)橄欖綠色，粉紅鐮刀菌(FusariuMroseum)暗培養(yǎng)呈現(xiàn)玫瑰色，串珠鐮刀菌(FusariuMmoMiliforme)RCEF4029菌株能產(chǎn)生紅色素[2-4]。

鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的色素，在功能上也具有多樣性。Elizabeth等人研究禾谷鐮刀菌（FusariuMgraMinearum）時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌產(chǎn)生的色素具有抑菌功能，能夠抑制酵母生長[5]。Alma等人發(fā)現(xiàn)多株輪狀鐮刀霉菌（FusariuMverticillioides）產(chǎn)生的色素與該菌的毒性有密切關(guān)系[6]。孫月娥等發(fā)現(xiàn)串珠鐮刀菌RCEF4029菌株產(chǎn)生的色素不同pH值條件下能呈現(xiàn)不同的顏色，可以滿足不同的著色要求[4]。

隨著基因技術(shù)的發(fā)展，目前對(duì)鐮刀菌屬產(chǎn)生色素的基因也有了一些研究，主要集中在對(duì)黃色鐮刀菌素和比卡菌素的合成基因的研究。黃色鐮刀菌素最早由Ashley等在黃色鐮孢菌（FusariuMculmorum）中發(fā)現(xiàn)，該色素為一種沉淀在細(xì)胞壁的紅色色素，屬于芳香族萘醌類的聚酮二聚體[7]。Sascha等人利用基因敲除的方法最先確認(rèn)了一個(gè)負(fù)責(zé)合成黃色鐮刀菌素的基因簇，并通過對(duì)禾谷鐮孢菌中PKS12基因的敲除，確認(rèn)了該基因的功能為編碼黃色鐮刀菌素的前體[8]。比卡菌素是一種深紅色的色素，也屬于芳香族的聚酮類化合物，最早從串珠鐮刀菌中分離得到。在串珠鐮刀菌中，該基因的合成由聚酮合酶基因bik1負(fù)責(zé)，并受到臨近5個(gè)基因的調(diào)控，敲除掉這5個(gè)基因中的任何一個(gè)都會(huì)導(dǎo)致比卡菌素合成量的急劇減少，甚至完全喪失[9]。

尖孢鐮刀菌是鐮刀菌屬的一個(gè)重要組成部分，是世界性分布的土傳病原真菌。其下根據(jù)是否致病，以及寄主專化型和小種差異等可細(xì)分為眾多生理小種。目前已報(bào)道的尖孢鐮刀菌?；秃托》N已經(jīng)超過120個(gè)[10]，而其中很多菌株都是有顏色的，且顏色各異，如此眾多的產(chǎn)色素菌株對(duì)應(yīng)的是豐富的色素資源。目前對(duì)尖孢鐮刀菌的研究大都集中在對(duì)其致病性的研究[11-15]，對(duì)色素的研究還相對(duì)較少[16]。筆者對(duì)尖孢鐮刀菌下的非致病尖孢鐮刀菌1262菌株和尖孢鐮刀菌粘團(tuán)?；?號(hào)生理小種Foc-am菌株的產(chǎn)色素條件進(jìn)行了研究，以期為后續(xù)對(duì)色素的萃取純化，進(jìn)而研究色素功能提供基礎(chǔ)，同時(shí)豐富對(duì)尖孢鐮刀菌色素的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌粘團(tuán)專化型（FusariuMoxysporuMf.sp.Conglutinans）1號(hào)生理小種，編號(hào)為Foc-am，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。尖孢鐮刀菌（FusariuMoxysporuMSchl.）1262號(hào)菌株由中國科學(xué)院微生物所提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.2 方法

基物pH值的調(diào)節(jié)測試方法：培養(yǎng)基裝入500ML三角瓶，每瓶300ML。滅菌后用20%乳酸和過飽和Na2CO3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值,用pH試紙測定pH值，將pH分別調(diào)節(jié)至4、5、6、7、8、9。

將各菌株于常規(guī)PDA平板上培養(yǎng)7 d，用滅菌的打孔器打取6mm的菌餅至pH為4～9的PDA平板的中央，每皿1塊。每個(gè)pH處理均取3皿置于兩組溫度為14±1°C、18±1°C、22±1°C、26±1°C、30±1°C的光照培養(yǎng)箱下，分別連續(xù)黑暗或連續(xù)光照培養(yǎng)，8 d后開始觀察記錄菌落色澤。

2 結(jié)果與討論

2.1 光照、溫度、pH對(duì)尖孢鐮刀菌菌株Foc-am和非致病菌株1262產(chǎn)色素的影響

試驗(yàn)結(jié)果分別見表1和表2，結(jié)果顯示：Foc-am在光照培養(yǎng)下菌落呈橘色，而在黑暗培養(yǎng)條件下，菌落無色。隨著溫度的升高，菌落顏色由橙色變?yōu)闇\黃色，基物顏色由橙色變?yōu)榘咨▓D1）。相同其他培養(yǎng)條件、不同pH值條件下，菌落顏色和基物顏色都沒有變化。

表1 光照、溫度、pH值對(duì)Foc-am產(chǎn)色素的影響

而1262菌株在同一溫度，同一光照條件下，菌絲顏色和基物都隨著培養(yǎng)基pH值的升高，由紫紅色逐漸變?yōu)闊o色，但當(dāng)其他培養(yǎng)條件相同時(shí)，在不同溫度和光照條件下，菌絲顏色和色素顏色都沒有明顯變化。部分培養(yǎng)條件下，菌落照片見圖2。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看到，尖孢鐮刀菌不同菌株之間色素產(chǎn)生的條件不盡相同。對(duì)于Foc-am菌株而言，在有光照的條件下，該菌株的菌落都能產(chǎn)生顏色，而溫度和培養(yǎng)基pH值這兩個(gè)因素則對(duì)其色素產(chǎn)生的影響不大；對(duì)于1262菌株而言，培養(yǎng)基pH值則對(duì)該菌株色素的產(chǎn)生起主導(dǎo)作用，在pH值升高到一定值后，會(huì)完全抑制該菌株產(chǎn)色素。Medentsev等人研究了多隔鐮刀菌（FusariuMdecemcellulare），禾谷鐮刀菌和瓜類萎蔫鐮孢菌（FusariuMbulbigenum）3種鐮刀菌產(chǎn)生萘醌類色素的條件，發(fā)現(xiàn)萘醌類色素的合成是一種真菌為了抵御環(huán)境壓力的手段[18]。兩種尖孢鐮刀菌的產(chǎn)色素條件不同，說明對(duì)于不同菌來說，造成環(huán)境壓力的因素不同。

表2 光照、溫度、pH值對(duì)1262產(chǎn)色素的影響

圖1 部分培養(yǎng)條件下，菌株Foc-am產(chǎn)色素情況（a d，b e，c f為分別為不同條件下Fo c-a m菌株菌落正、背面照，培養(yǎng)條件分別為：14℃，光照，p H=4；26℃，光照，p H=8；14℃，暗培養(yǎng)，p H=4。）

圖2 部分培養(yǎng)條件下，菌株1262菌落產(chǎn)色素情況（a d，b e，c f分別為不同條件下1262菌株菌落正、背面照，培養(yǎng)條件分別為：26℃，光照，p H=4；26℃，光照，p H=7；26℃，光照，p H=8。）

對(duì)于鐮刀菌產(chǎn)色素條件的影響，也有科研者做了一定的研究。王拱辰等證明了培養(yǎng)基的pH值能影響李瑟組鐮刀菌的菌落形態(tài)、色澤，李瑟組鐮刀菌在pH 6～7范圍內(nèi)生長最適，當(dāng)pH 3～4時(shí)菌落偏向紅色，pH 6～7時(shí)菌落為紫色，pH 10則有些菌株變?yōu)榈{(lán)色、灰色[17]。藍(lán)江林等研究了pH脅迫下6個(gè)尖孢鐮刀菌菌株的生長動(dòng)力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌的最適生長pH值為5～8，且培養(yǎng)基的pH值能影響部分菌株菌落的色澤[19]。崔堂兵等研究了尖孢鐮刀菌發(fā)酵產(chǎn)色素的最適碳源、氮源及無機(jī)鹽，并用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)主要營養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最適發(fā)酵條件為：初始pH 6.0，裝液量50～250ML，吐溫－80添加量1%，接種量10%，28℃，200 r/Min[15]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，比卡菌素合成酶基因bik1的表達(dá)受到高含量氮源和堿性pH值的抑制。該基因在少量氮源或者酸性pH值的條件下能夠大量表達(dá)[9]。而高pH值是黃色鐮刀菌素產(chǎn)生的重要條件[8]。結(jié)合這些研究結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可推斷1262菌株產(chǎn)生的色素可能為比卡菌素的類似物，而Foc-am菌株產(chǎn)生的色素的條件與已知的兩種色素產(chǎn)生條件都有差異，推斷可能為一種新的色素。1262菌株產(chǎn)生的色素，色澤濃郁，光照不影響其穩(wěn)定性，且在較大pH范圍內(nèi)都能保持穩(wěn)定的色澤，有一定的應(yīng)用價(jià)值。而Foc-am菌株產(chǎn)生的色素則可能為一種新的色素，具體功能有待于萃取純化后進(jìn)一步研究分析。3結(jié)論

尖孢鐮刀菌的不同種和菌株之間產(chǎn)生色素的條件有差異。非致病尖孢鐮刀菌菌株1262在pH＜7的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，1262菌株可產(chǎn)生紫紅色色素，在pH＞7的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，1262菌株產(chǎn)生少量或者不產(chǎn)生色素。培養(yǎng)溫度和光照條件對(duì)1262菌株色素的產(chǎn)生影響不大。結(jié)合已有的研究結(jié)果，推斷該色素可能為比卡菌素的類似物，有一定的應(yīng)用價(jià)值。尖孢鐮刀菌甘藍(lán)?；途闒oc-am，黑暗條件下不產(chǎn)生色素，光照下可產(chǎn)生橙色色素，而培養(yǎng)基的pH和溫度對(duì)其色素的產(chǎn)生影響不大。結(jié)合前人的研究結(jié)果，推斷該色素可能為一種新的色素，具體功能有待進(jìn)一步分析確認(rèn)。

[1]張永強(qiáng),龍 婷,牛亞軍，等.天然蒽醌類化合物口服吸收及代謝研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2014,26(7)∶1-5.

[2] L. Zheng, Y. Peng, J. Zhang, et al. First report of Fusarium solani causing root rot of juglans sigllata dode in China[J]. Plant Dis, 2015, 99(1)∶ 159.

[3] Shyamji S, Harshita S, Akhilesh KP. Optimization of various parameters for production of antimicrobial compounds by Fuasrium roseum FGCC#61[J]. WJPPS. 2014, 3(12)∶ 890-905.

[4]孫月娥,邵 穎,陳安徽，等.一株串珠鐮刀菌內(nèi)紅色素穩(wěn)定性及部分生理活性研究[J].食品科學(xué),2011,32(19)∶54-59.

[5] Muriuki E, Hall C, Sasanya JJ, et al. Purification, analysis and antimicrobial activity of Fusarium Graminearum pigment [J]. Plantation Lobby, 2008, 15∶ 928.

[6] Alma RS, Carlos DLeón-García De Alba, Guadalupe V, et al. The pigmentation of Fusarium verticillioides (Sacc.) as factor of virulence in maize seedlings[J]. Agrono Mesoam, 2011, 22(2)∶ 297-307.

[7] Medentsev AG, Akimenko VK. Naphthoquinone metabolites of the fungi [J]. Phytochemistry, 1998, 47∶ 935-959.

[8] Malz S, Grell MN, Thrane C, et al. Identi?cation of a gene cluster responsible for the biosynthesisofaur of usarininthe Fusariumgraminearum species complex[J]. Fungal Genet Biol, 2005, 42∶ 420-433.

[9 ] Wilemann P, Willmann A, Straeten M, et al. Biosynthesis of the red pigment bikaverin in Fusarium fujikuroi∶ genes, their function and regulation[J]. Mol Microbiol, 2009, 72(4)∶ 931-946.

[10]王政逸,李德葆.尖孢鐮刀菌的遺傳多態(tài)性[J].植物病理學(xué)報(bào)，2000，(03)∶193-199.

[11]裴月令,曾凡云,彭 軍，等.尖孢鐮刀菌與寄主互作機(jī)理研究進(jìn)展[J].熱帶生物學(xué)報(bào),2014,5(1)∶92-100.

[12]梁麗琴,李健強(qiáng),楊宇紅，等.植物與尖孢鐮刀菌的互作機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,30(21)∶40-46.

[13] F. Gawehns, P. M. Houterman, F. Ait Ichou, et al. The Fusarium oxysporum effector Six6 contributes to virulence and suppresses I-2-mediated cell death[J]. Mol Plant Microbe In, 2014, 27(4)∶ 336-348.

[14] Qian-Hao Z, Stuart S, Jennifer T, et al. Long noncoding RNAs responsive to Fusarium oxysporum infection in Arabidopsis thaliana[J].New Phytol, 2014, 201(2)∶ 574-584.

[15] Yolanda MG, James AM, Bruce SM, et al. Field resistance to Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae in transgenic cotton expressing the plant defensin NaD1[J]. J Exp Bot, 2014, 65(6)∶ 1541-1550.

[16]崔堂兵,劉清香.尖孢鐮刀菌生產(chǎn)蒽醌色素的液體發(fā)酵條件研究[J].中國生物工程雜志,2010,30(09)∶56-61.

[17]王振辰,顧振芳,陳長華,等.鐮刀菌李瑟組研究Ⅲ.鐮刀菌李瑟組的生長發(fā)育和培養(yǎng)基p H值關(guān)系的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),1995,22 (1)∶5-9.

[18] Medentsev AG, Arinbasarova AI, Akimenko VK. Biosynthesis of naphthoquinone pigments by fungi of the genus Fusarium[J]. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2005, 41(5)∶ 573-577.

[19]藍(lán)江林,肖榮鳳,劉 波，等.p H脅迫下尖孢鐮刀菌生長動(dòng)力學(xué)模型[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,20(11)∶1532-1538.

（責(zé)任編輯：張煥裕）

Conditions for the Production of Pigment froMTwo Kind of FusariuMoxysporuMStrains

XIAO Ji-ling1，SHEN Bao-Ming1,2，XIEBing-yan1，YANG Yu-hong1*
（1.Institute of Vegetable and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,PRC; 2.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC）

The genus FusariuMare capable of producingmany kinds of pigmentsw ith different of functions.To explore the resources of natural pigmentsof the genus Fusarium,the effectsof light,different temperature and pH on the production of pigment froMtw o isolatesof FusariuMoxysporuMcultured on PDA mediuMwere investigated.The results were different between the nonpathogenic FusariuMoxysporuMisolate 1262 and the FusariuMoxysporuMf.sp.Conglutinans isolate Foc-am.The isolate of 1262 produced purple pigment w hen the mediuMof pH＜7.When themediuMpH＞7,it produced a small amount of pigment or no pigment.The light and culture temperaturewere irrelevant to its pigmentproduction.As to Foc-am,itproduced orange pigment in light.And culturing temperature and the mediuMpH show ed irrelevant to its pigment production.The result show s that the ambient conditions for produce pigments of the tw o isolates of FusariuMoxysporuMare different,and by changing the ambient conditions tomake the FusariuMoxysporuMw hich is normally unable to produce pigmentproduce pigmentgiveusa new method to explore new resourcesof natural pigments.

FusariuMoxysporum;strain;pigment;teMperature

Q815

A

1006-060X（2015）04-0105-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.033

2015-03-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272003)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) （C AR S-25-B-01）；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BA D19B06）；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目。

肖姬玲（1988-），女，湖南邵陽市人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)。

楊宇紅