八仙花葉片誘導(dǎo)再生技術(shù)

趙盈盈，彭盡暉，陳小超，黃 宇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

八仙花葉片誘導(dǎo)再生技術(shù)

趙盈盈，彭盡暉，陳小超，黃 宇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

以八仙花（Hydrangea macrophylla 'Adria）' 紅色品種無菌苗為試驗(yàn)材料，使用其葉片為外植體進(jìn)行再生研究，建立了八仙花葉片高效離體再生體系。結(jié)果顯示：適宜的葉片誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5Mg/L+IAA 0.2Mg/L，出愈率達(dá)100%；適宜的芽直接誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0Mg/L+N AA 0.3Mg/L，分化率可達(dá)80%；暗培養(yǎng)15 d是葉片誘導(dǎo)芽再生最適合的時(shí)間。最適宜的葉片切割大小是垂直于主脈切兩刀，但是不能斷開，此時(shí)芽誘導(dǎo)率最佳。切取3 c m高的無菌苗接種在生根培養(yǎng)基上，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+蛭石和珍珠巖各一半混合，不添加激素，生根率達(dá)100%，且根生長健壯。

八仙花；葉片再生；暗培養(yǎng)

八仙花（Hydrangeamacrophylla）為虎兒草科木本觀賞植物，原產(chǎn)于中國和日本。因其花大色艷，寓意美好，深受人們的喜愛[1]?，F(xiàn)代花卉市場上，八仙花的生產(chǎn)量遠(yuǎn)不及其需求量。關(guān)于八仙花組織培養(yǎng)的報(bào)道較多，任叔輝等[2-7]以八仙花帶腋芽的莖段、莖尖、葉柄和葉片為外植體，分別獲得了八仙花的再生體系。2011年馮潤東等[8]報(bào)道了八仙花組織培養(yǎng)技術(shù)，之后劉峰[9]以八仙花葉片為外植體，誘導(dǎo)出了不定芽，王忠武[10]報(bào)道了關(guān)于八仙花莖尖離體培養(yǎng)，但近年來幾乎沒有關(guān)于八仙花組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道。八仙花多為不育花，難以通過傳統(tǒng)的雜交育種獲得優(yōu)良性狀，而分子技術(shù)的興起克服了這一障礙。分子技術(shù)育種可以定向修改某一特定形狀而不改變其原有的性狀，但是遺傳轉(zhuǎn)化需要良好的受體，而植物葉片是分子轉(zhuǎn)化中最佳受體。因此，研究植物葉片再生可以為今后分子遺傳轉(zhuǎn)化提供良好的受體[1]。關(guān)于植物葉片直接再生的研究較多，最近報(bào)道的有關(guān)于無患子優(yōu)樹[11]、‘惠’蘋果自交實(shí)生苗[12]、歐洲甜櫻桃砧木‘SL64’離體[13]、結(jié)球甘藍(lán)離體[14]、玫瑰[15]、‘北林雄株1號’和‘北林雄株2號’[16]及番茄[17]等植物葉片再生的研究。本試驗(yàn)主要研究八仙花葉片直接再生體系的建立，為今后八仙花分子遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為八仙花紅色品種（H.macrophylla 'Adria）'，見圖1所示，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞園藝研究所提供。

圖1 試驗(yàn)八仙花品種

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)條件 光照時(shí)間約14 h，光照強(qiáng)度約1 500～2 000 lx，培養(yǎng)溫度25℃左右。

1.2.2 八仙花葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 挑選長勢一致、生長健壯的八仙花組培苗，選取頂端葉面充分展開的幼嫩葉片，垂直葉片主脈方向剪切3～5個傷口將其葉背朝下與誘導(dǎo)培養(yǎng)基充分接觸培養(yǎng)。接種于以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同配比激素的培養(yǎng)基上。每個處理接種10瓶且每瓶接種5個葉片，設(shè)3個重復(fù)接種后70 d觀察愈傷組織的分化情況，統(tǒng)計(jì)其出愈率。

1.2.3 八仙花葉片不定芽直接誘導(dǎo)培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同配比激素的培養(yǎng)基上。接種后70 d檢查出芽率。

1.2.4 葉片切割大小對芽直接再生的誘導(dǎo) 將生長健壯的葉片切割成面積大小不同的正方形，轉(zhuǎn)接到6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L的培養(yǎng)基上，先放到暗條件下培養(yǎng)15 d后，轉(zhuǎn)到其他條件相同的光下培養(yǎng)。70 d后觀察芽的增殖情況。

1.2.5 暗培養(yǎng)對芽直接再生的誘導(dǎo) 設(shè)置暗培養(yǎng)0 10、15、20、25 d 5種處理，黑暗培養(yǎng)完成后將其轉(zhuǎn)到光下繼續(xù)培養(yǎng)；以0 d暗培養(yǎng)為對照。接種70 d統(tǒng)計(jì)其出芽率。

1.2.6 再生植株的生根培養(yǎng) 將生長至3 cm以上的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每組處理接種2瓶，每瓶接種5個不定芽，設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)基均為1/2MS培養(yǎng)基，不添加任何激素。25 d后觀察其生根情況，統(tǒng)計(jì)其平均根長，平均生根數(shù)和生根率。

1.2.7 計(jì)算公式 出愈率（%）=（產(chǎn)生愈傷葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù)）×100

出芽率（%）=(分化芽的葉塊數(shù)/接種的葉塊數(shù))× 100

再生芽平均數(shù)（個）=葉片再生芽的總數(shù)/再生芽的葉片數(shù)

生根率(%)=(生根試管苗數(shù)/接種試管苗數(shù))×100

2 結(jié)果與分析

2.1 八仙花葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

由表1可知，處理1的出愈率在6組培養(yǎng)基中最低，僅為54%。隨著6-BA的濃度增加到2.5mg/L，出愈率提高到100%。處理5產(chǎn)生愈傷葉片個數(shù)最多，平均為50個，即所有的葉片均能在此培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷。從表1中還可以看出，隨著6-BA濃度的增加，出愈率也隨著增加，說明在一定情況下高濃度的細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞的分化，但是當(dāng)濃度增加到3.0mg/L時(shí)，出愈率減弱，說明較高的細(xì)胞分裂素能夠抑制葉片愈傷組織的產(chǎn)生。由此可知，2.5mg/L的6-BA有利于八仙花葉片產(chǎn)生愈傷組織。因此，處理5（MS+ 6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L）是最適合八仙花葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對八仙花葉片出愈率的影響

2.2 葉片切割大小對芽誘導(dǎo)的影響

由表2可知，將葉片切割成大小不同的正方形接種于培養(yǎng)基上，葉片切割較小時(shí)，出芽率芽和平均數(shù)都較低，不利于芽的再生。但是將整個葉片垂直于主脈切兩刀，出芽率可達(dá)90%，芽平均數(shù)也達(dá)到了7.2個。由此可知：八仙花葉片再生最佳切割方式是，不應(yīng)將主脈切斷，而是傷其主脈后直接將整個葉片放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

大?。╟ m）3 × 3 5 × 5整片葉片接種葉片（片）1 0 1 0 1 0分化葉塊（塊）1 6 9芽分化（個）1 3 1 6 6出芽率（%）1 0 6 0 9 0芽平均數(shù)（個）1 . 0 5 . 0 7 . 2

2.3 八仙花葉片不定芽直接誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將生長健壯的葉片放入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不同濃度激素的培養(yǎng)基對葉片直接誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生影響很大。表3表明：10組處理中，處理8分化的葉片數(shù)最多，為43個，芽誘導(dǎo)率最高達(dá)86%，不定芽分化總數(shù)可達(dá)172個，單個葉片平均分化芽數(shù)也最多，高達(dá)4.0個，與其他培養(yǎng)基的分化率差異也較為顯著。與處理8相比，處理7雖然只有28個葉片有芽的分化，但是其平均再生芽個數(shù)也達(dá)到了4.0個，且芽生長粗壯，顏色濃綠，傷口處還有顏色濃綠、生長緊密的愈傷組織出現(xiàn)。處理9雖然出芽率可達(dá)78%，但是其平均再生芽個數(shù)較少，其芽較為健壯。由以上數(shù)據(jù)可知，要讓葉片直接分化出芽，且芽健壯易于在繼代培養(yǎng)基上增殖生長，最適的培養(yǎng)基為處理8即6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3 mg/L。

2.4 暗培養(yǎng)對芽直接再生的誘導(dǎo)

暗培養(yǎng)一段時(shí)間有利于芽的分化[6]。由表4可知：八仙花在暗處理15 d后芽的分化率最高，芽分化平均數(shù)可達(dá)7.2個。八仙花葉片增殖過程如圖2所示，重芽分化量多，且芽生長健壯。但是過長時(shí)間的暗培養(yǎng)處理，不利于芽的分化。研究還發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，八仙花葉片很難分化愈傷組織，但是將葉片進(jìn)行一段時(shí)間的暗處理，然后將其在光照下培養(yǎng)，在較短的時(shí)間內(nèi)就有大量的愈傷分化。

表3 不同激素對八仙花不定芽誘導(dǎo)率與再生芽數(shù)的影響

2.5 再生植株的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

從表5可知：在不同基質(zhì)上，八仙花幼苗均能長出根來，且生根率在80%以上，其中處理1、2、4、5的生根率可達(dá)到100%。其中處理4、5、7的平均生根數(shù)達(dá)到14條及以上，且處理5的生根數(shù)達(dá)到了25以上，根系生長粗壯濃密，且有側(cè)根的分化，芽生長健壯。由此可知，粗蛭石+珍珠巖作為八仙花生根誘導(dǎo)的基質(zhì)更加有利于根的分化和生長，而直徑較小的細(xì)蛭石和凝固的瓊脂會產(chǎn)生大量氣生根。所以，粗蛭石+珍珠巖是八仙花根誘導(dǎo)分化的最佳基質(zhì)。如圖3所示，6種基質(zhì)各有優(yōu)缺點(diǎn)。瓊脂能更好地固定不定芽，但是其透氣性相對較差，容易被細(xì)菌污染導(dǎo)致植株死亡；細(xì)蛭石和珍珠巖，可以相對好的保水和固定無菌苗，但其透氣性也相對較弱，易導(dǎo)致植株與其接觸部分潰爛，使植株后期生長較弱；粗蛭石雖然透氣性較好，但是保水能力相對較弱，不易固定植株；植株入土種植后生長更加健壯，且根系發(fā)達(dá)。但是從后期生長來看，粗蛭石+珠巖的苗子能更好地適應(yīng)環(huán)境。

表4 暗處理對八仙花葉片分化的影響

圖2葉片增殖過程（A，接種5 d的葉片；B，開始出現(xiàn)芽點(diǎn)；C，出現(xiàn)一個子葉；D，出現(xiàn)兩片子葉；E、F，大量芽產(chǎn)生；G，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)的芽）

3 討論與結(jié)論

植物激素對八仙花葉片的出愈率和芽誘導(dǎo)率都有較大的影響。在八仙花葉片愈傷組織誘導(dǎo)的過程中，隨著細(xì)胞分裂素即6-BA濃度的增加，出愈率呈現(xiàn)先升高后降低的變化，因而選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素濃度對八仙花葉片直接再生誘導(dǎo)有著極為關(guān)鍵的意義。選擇較高的細(xì)胞分裂素和較低的生長素，有利于愈傷組織的分化。細(xì)胞分裂素與生長素NAA的比值在3.0∶0.3時(shí)，有利于芽的直接再生。

表5 不同基質(zhì)對八仙花不定芽生根的影響

圖3 植株生根培養(yǎng)

適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)可促進(jìn)芽的分化，但應(yīng)注意的是暗培養(yǎng)時(shí)間過長，不但不能促進(jìn)芽的分化，愈傷組織也很難形成。劉峰[9]在研究八仙花葉片分化時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了一定的暗培養(yǎng)可以誘導(dǎo)芽的分化。師校欣等[18]認(rèn)為，暗培養(yǎng)可以促進(jìn)試管苗的生長與生根，這與內(nèi)源激素的變化有關(guān)，通常認(rèn)為生長素可促進(jìn)生根，生長素IAA易在光照條件下分解。但也有報(bào)道認(rèn)為，暗處理可使黑桃試管苗生根率提高，而在光照條件下IAA含量始終大于暗培養(yǎng)條件[19]。暗培養(yǎng)促進(jìn)芽分化與暗培養(yǎng)促進(jìn)根的生長有什么不同的地方還無從得之，也沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，光照條件為何會導(dǎo)致芽分化率降低且分化速度緩慢，還需要進(jìn)一步的研究證明。

本試驗(yàn)采用在1/2MS培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中，加入不同基質(zhì)誘導(dǎo)八仙花幼苗生根。添加的幾種基質(zhì)，市場上容易買到，價(jià)格便宜，能重復(fù)利用，且生根率高，不易有氣生根的產(chǎn)生。氣生根的產(chǎn)生，可能是因?yàn)榄傊图?xì)蛭石之間空隙較小，氧氣缺乏。使用粗的蛭石幾乎無氣生根產(chǎn)生。

最近的研究主要集中于獲得八仙花的脫毒苗，而八仙花外植體消毒，品種差異大，不定芽分化率低等問題仍然是急需解決的問題[1]。而之前的文章主要介紹了快速繁殖獲得無菌苗運(yùn)用在生產(chǎn)上，少有文章提及分子技術(shù)遺傳育種。本試驗(yàn)中采用葉片為外植體，建立八仙花高效再生體系，可為八仙花今后的分子育種提供基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：盧紅玲）

Leaf Regeneration Technology of Hydrangea Macrophylla

ZHAO Ying-ying，PENG Jin-hui，CHEN Xiao-chao，HUANG Yu
（College of Horticulture and Landscape,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC）

An efficaciousmethod for plants regenerate froMleaf exp lants of Hydrangeamacrophylla was established.The optimal callus inducingmediuMfor Hydrangeamacrophylla leaveswasMS+6-BA 2.5mg/L+IAA 0.2mg/L,and the callus induction rateswas 100%. The resultsshowed thatbud differentiation thegreatmediuMwasMS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L,and thebud differentiations rate was80%.The proper timewhich could promote bud’sdifferentiation of the leafwas darkness treatment for15 days.Perpendicular to the main vein cut two kniveswas bestway to the bud differentiations.Buds over 3 cMheightcould forMadventitious roots in 1/2MS+50% vermiculite+50%perlitewithouthormone,and the rateof rootingwasup to 100%.

Hydrangeamacrophylla;leaf regeneration;dark treatment

S685.99

A

1006-060X（2015）04-0081-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.026

2014-10-30

國家自然基金青年項(xiàng)目（N o.31201656）；湖南省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（C X1112）

趙盈盈（1989-），女，貴州綏陽縣人，碩士研究生，研究方向?yàn)橛^賞園藝分子技術(shù)。

彭盡暉