通蓮Ⅰ號方抑制小鼠食管癌移植瘤生長作用及其機制研究

張艷麗 賈永森 趙 刃 包巨太

（1.遷安燕山醫(yī)院，河北遷安064400；2.河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院，河北唐山063000；3.唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山063000）

通蓮Ⅰ號方抑制小鼠食管癌移植瘤生長作用及其機制研究

張艷麗1賈永森2趙 刃3包巨太2

（1.遷安燕山醫(yī)院，河北遷安064400；2.河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院，河北唐山063000；3.唐山市中醫(yī)醫(yī)院，河北唐山063000）

目的：研究通蓮I號方對食管癌Eca109細胞荷瘤小鼠的抑瘤作用及其對腫瘤組織免疫因子TNF-α、IL-6和IL-8的影響。方法：食管癌Eca109細胞接種于小鼠右前肢皮下。小鼠隨機分為模型組和通蓮I號方低、中、高劑量組，分別灌胃生理鹽水和通蓮I號方各劑量。各組連續(xù)給藥3周，末次給藥結(jié)束3周后分離小鼠瘤組織，計算抑瘤率，ELISA法檢測腫瘤組織上清液TNF-α、IL-6和IL-8含量。結(jié)果：通蓮I號方高劑量組瘤重明顯低于模型組（P＜0.05），抑瘤率明顯高于通蓮I號方低劑量組（P＜0.05）。HE染色可見，通蓮I號方高劑量組的腫瘤細胞淡染，核分裂較少，可見較多腫瘤細胞腫脹變性壞死。通蓮I號方高劑量組腫瘤組織TNF-α、IL-6和IL-8表達明顯低于模型組與通蓮I號方中、低劑量組（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：通蓮I號方可抑制小鼠食管癌Eca109細胞移植瘤生長，其抑瘤機制與下調(diào)瘤組織TNF-α、IL-6和IL-8等因子水平，增強免疫調(diào)節(jié)有關。

通蓮I號方 食管癌 Eca109細胞 荷瘤小鼠 腫瘤壞死因子-α 白介素-6 白介素-8 病理學

食管癌屬于中醫(yī)“噎膈”范疇，病機多為氣滯、痰阻和血瘀阻滯食道，造成津傷血枯，食管干澀，飲食難下。有報道顯示，中國男、女食管癌發(fā)病率和死亡率均居全球第1位[1]。本研究組創(chuàng)制活血行氣復方——“通蓮I號方”治療食管癌獲得了較好的臨床療效，并已獲得國家專利[2]。前期研究表明，該方可調(diào)節(jié)細胞周期抑制食管癌細胞增殖[3]，其抑癌分子機制與下調(diào)核因子kappa B（NF-κB）信號通路蛋白表達有關[4]。本研究通過荷瘤小鼠體內(nèi)實驗，進一步觀察了通蓮I號方對食管癌移植瘤的抑制作用以及對免疫因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）的影響。

1 實驗材料

1.1 動物 4～5周齡昆明小鼠，雌、雄各半，體質(zhì)量20～25g，清潔級，購于中國食品藥品檢定研究院，合格證號：SCXK（京）2009-0017。

1.2 細胞株 食管癌Eca109細胞，購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。

1.3 藥物 通蓮I號方（桃仁、紅花、升麻、檳榔、半枝蓮、白花蛇舌草，劑量比為2∶1∶1∶1∶3∶3），各單味藥物均購于唐山市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，由河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院中心實驗室中藥制劑室制備，提取液含生藥材1.8g/mL。按人與小鼠換算比計算出高、中、低劑量（生藥量濃度分別為1500、750、375mg/L），以生理鹽水（NS）配成。

1.4 試劑 新生小牛血清（GIBCO公司），DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），胰蛋白酶（GIBCO公司）；噻唑藍（MTT，Amresco公司），二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司），IL-6、IL-8和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（YYES BIOTECH公司），以上試劑均購自北京科海榮京生物科技公司。

1.5 儀器 1100型無菌超凈臺 （FORMA公司），3336型CO2培養(yǎng)箱 （FORMA公司），NOVAPATH 450酶標光度計 （Bio-Tek公司），TMD-2倒置式顯微鏡（NIKON公司），3MK型低溫高速離心機（SIGMA公司），JJ-2型組織勻漿機（Waring公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 小鼠隨機分為4組，分別為模型組和通蓮 I號方高、中、低劑量組。將 Eca109細胞以 1×107/mL的濃度接種于小鼠右前肢皮下，2周后成模（剔除瘤體過大或過小者）。模型組灌胃NS 10mL/kg；通蓮I號方高、中、低劑量組分別灌胃 1500、750、375mg/L中藥液，給藥量均為10mL/kg。各組均連續(xù)給藥3周，再繼續(xù)飼養(yǎng)3周后將小鼠頸椎脫臼處死，檢測相關指標。

2.2 抑瘤率 各組小鼠處死后，取腫瘤組織于電子天平上稱取瘤重，按照如下公式計算抑瘤率：

抑瘤率=（模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%

2.3 形態(tài)學觀察 取部分剝離的瘤組織以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4μm厚的切片，HE染色，光鏡下觀察瘤組織細胞形態(tài)。

2.4 ELISA法檢測移植瘤瘤體組織上清液中TNF-α、IL-6和IL-8蛋白表達 荷瘤小鼠瘤體組織取材，取樣約100mg，加入1mL生理鹽水研磨，6000r/min離心15min，取上清液。在標準品孔及待測樣本孔中分別加入50μL酶聯(lián)親和物，37℃溫育60min，反復沖洗，排除水分。分別加入顯色液A、B各50μL，室溫下避光反應15min。加入終止液50μL，終止反應。檢測不同濃度TNF-α、IL-6和IL-8標準品及各組瘤體組織上清液樣本。記錄上清液在450nm處的光密度值（OD），根據(jù)OD值計算各指標含量。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差別顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組平均瘤重及藥物抑瘤率比較 通蓮I號方高劑量組瘤重較小，與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）。通蓮I號方各劑量組抑瘤率比較，高劑量組抑瘤率明顯高于低劑量組（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠平均瘤重及藥物抑瘤率（±s）

表1 各組小鼠平均瘤重及藥物抑瘤率（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與通蓮I號方低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只）模型組 10通蓮I號方高劑量組 10通蓮I號方中劑量組 10通蓮I號方低劑量組 10瘤重（g） 抑瘤率（%）3.57±1.05 1.51±0.49*# 61.04±4.79# 2.28±0.87 41.39±3.08 3.05±1.29 22.56±2.74

3.2 各組小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學觀察 模型組瘤組織內(nèi)腫瘤細胞核仁深染，腺體擁擠，血竇豐富；通蓮I號方高劑量組腫瘤細胞淡染，核分裂較少，可見較多腫瘤細胞腫脹變性壞死；通蓮I號方中、低劑量組腫瘤細胞多數(shù)深染，可見少量壞死區(qū)，但整體結(jié)構(gòu)與模型組相似。見圖1。

3.3 各組腫瘤組織上清液TNF-α、IL-6和IL-8含量比較 與模型組比較，通蓮I號方高劑量組TNF-α、IL-6和IL-8明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。通蓮I號方各劑量組組間比較，高劑量組各指標明顯高于中、低劑量組（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學病理切片（×200）

表2 各組小鼠移植瘤瘤體組織TNF-α、IL-6和IL-8含量（±s） pg/mL

表2 各組小鼠移植瘤瘤體組織TNF-α、IL-6和IL-8含量（±s） pg/mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與通蓮I號方中劑量組比較，▲P＜0.05；與通蓮I號方低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只）IL-8 TNF-α IL-6模型組 10264.48±23.55通蓮I號方高劑量 10通蓮I號方中劑量 10通蓮I號方低劑量 10 123.30±17.64 187.67±19.80 61.82±14.43**▲# 120.49±15.61*▲# 104.56±13.58 179.12±17.54 108.78±16.32 185.35±20.79 181.09±29.51*▲# 263.66±31.49 278.15±26.34

4 討論

通蓮I號方專為食管癌氣滯血瘀、熱毒內(nèi)結(jié)而設。方中半枝蓮和白花蛇舌草清熱解毒，解除體內(nèi)之瘀毒；升麻升清，檳榔下行，一升一降，胃氣乃通；桃仁和紅花活血行氣。全方重在活血行氣、解毒散結(jié)。本研究結(jié)果表明，通蓮I號方高劑量組小鼠瘤體生長受到顯著抑制，抑瘤率達到60%左右，瘤重明顯低于模型組和通蓮I號方低劑量組 （P＜0.05），可見高劑量組抑瘤作用顯著；而通蓮I號方中、低劑量組抑瘤率與模型組比較無統(tǒng)計學差異。

組織形態(tài)學HE染色結(jié)果顯示，通蓮I號方高劑量組與模型組比較，瘤體組織結(jié)構(gòu)改變較明顯，瘤組織內(nèi)有大片壞死區(qū)；中、低劑量組瘤體切片中央雖然也有散在壞死區(qū)，但面積較小，深染部分占絕大多數(shù)視野，與模型組相似。表明高劑量的通蓮I號方可促進瘤體組織壞死，對腫瘤生長有明顯抑制作用。

免疫調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是由巨噬細胞/單核細胞活化產(chǎn)生的一種細胞因子，在炎癥反應、細胞免疫和腫瘤免疫中發(fā)揮關鍵作用，局部高濃度的TNF-α具有抗腫瘤活性[5]。IL-6具有多種生物學活性，可以調(diào)節(jié)其他多種因子的作用，其主要通過調(diào)控細胞周期相關基因，促進腫瘤血管生成，促進腫瘤局部炎癥反應和腫瘤肝細胞自我更新等多種機制促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6]。IL-8是由巨噬細胞和上皮細胞等分泌的白介素亞類細胞因子，它可以通過刺激血管生成直接促進腫瘤生長，較高水平的IL-8與腫瘤患者體重減輕、惡病質(zhì)形成有直接關系[7]。

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠TNF-α水平最高，這和許多同類研究報道一致。本研究觀察到較高濃度的TNF-α出現(xiàn)在核仁深染、腺體擁擠、血竇豐富的模型組，這提示食管癌的TNF-α表達水平與腫瘤細胞活性呈正相關。而經(jīng)高劑量通蓮I號方干預的小鼠腫瘤組織中TNF-α水平顯著降低，與模型組比較有極顯著性差異（P＜0.01）。模型組小鼠IL-6和IL-8含量最高，而通蓮I號方高劑量組顯著下降，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）。通蓮I號方中、低劑量組的上述三項指標變化甚微，與模型組比較無顯著性差異；各劑量組間比較，高劑量組與中、低劑量組顯示出顯著性差異（P＜0.05）。本研究從免疫調(diào)節(jié)角度證明了高劑量的通蓮I號方抑制食管癌的部分機制。

綜上，通蓮I號方有較好的抑制食管癌荷瘤小鼠瘤體生長作用，通過誘導腫瘤組織壞死，下調(diào)腫瘤組織TNF-α、IL-6和IL-8等免疫因子水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。需要指出的是，多靶點作用是中藥復方抗癌的優(yōu)勢，本研究僅從宏觀瘤體變化、組織形態(tài)學和若干免疫因子差異等方面做了探討，其是否涉及與免疫調(diào)節(jié)相關的分子信號通路或者基因表達的變化等，值得進一步深入探討。

[1] Wang L，Tang W，Chen S，et al.N-acetyltransferase 2 Polymorphisms and Risk of Esophageal Cancer in a Chinese Population.PloS One，2014，9（2）：877

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[3] 賈永森，李繼安，韓炳生，等.通蓮Ⅰ號方及其拆方對食管癌Eca109細胞增殖及細胞周期的影響.中國實驗方劑學雜志，2012，18（12）：191

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R735.1 文獻標識碼 A 文章編號 1672-397X（2015）04-0075-03

河北省自然科學基金（H2013209053）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（2014185）

張艷麗（1980-），女，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，從事中醫(yī)內(nèi)科臨床研究工作。

賈永森，醫(yī)學博士，副教授。jysen@163. com

2014-11-15

吳 寧