用于絲綢制品生物抑菌材料的研究＊

章向陽，陳 良

（博約生物科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州215123）

絲綢制品在溫濕的氣候條件下，極容易受到微生物的攻擊，使得制品產(chǎn)生霉菌以及細菌，從而影響其使用價值［1-2］。研究表明對絲綢制品破壞作用最大的是藻菌綱的根霉屬（Rhizopus Ehrenberg）、子囊菌綱的擬青霉屬（Penicilliopsis Solms-Laubach）以及半知菌類的黑曲霉組（A.niger）［2］，而影響最大的細菌是大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。目前研究和應(yīng)用的絲綢抑菌劑基本是有機合成制劑，其固有的化學(xué)特性極容易造成對人體的危害，因此具有一定的應(yīng)用局限性。由天然植物提取而制成的絲綢纖維生物抑菌劑是經(jīng)生物處理，既有抑菌功能且對人體無毒害，是當今研究和發(fā)展的一個趨勢，目前國內(nèi)外還沒有研究和成熟的產(chǎn)品見于報道。因此用于絲綢纖維的生物抑菌研究還是一個空白。

目前世界上具有抑菌活性成分的植物有兩千多種。這些植物具有抑菌性好、毒性低、來源豐富和價格低廉等優(yōu)點，都很有希望成為絲綢抑菌防腐劑開發(fā)的資源［3-8］。

1 實驗

1.1 材料和儀器

生物抑菌材料：辣木籽、苦參、黃芩、黃柏、地膚子、蛇麻子、土槿皮、山銀花、茯苓、火麻仁、大蒜素、穿心蓮、金養(yǎng)麥、苦術(shù)、黃連。

供試霉菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC3.5487。

供試細菌種：大腸桿菌Escherichia coli（8099）革蘭氏陰性；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（ATCC 6538）革蘭氏陽性。

培養(yǎng)基：

供霉菌試驗：察氏液體培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、無機鹽營養(yǎng)液、無機鹽培養(yǎng)基（另添加3%葡萄糖）。

供細菌試驗：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、SCDLP液體培養(yǎng)基。

儀器：YP B1003電子天平、B-260恒溫水浴鍋、CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器、JB90-D強力電動攪拌機、JB-CJ-1F型超凈工作臺，Autoclavo ES2315型高壓滅菌，ZHWY22102型恒溫培養(yǎng)箱，SPX型智能生化培養(yǎng)箱，SPX-2C型顯微鏡并配攝像設(shè)備。

1.2 前期快速抑菌檢測方法

為了快速評價生物抑菌材料的實際抑菌效果。我們采用植物膠營養(yǎng)基培養(yǎng)法對生物抑菌材料的抑菌性進行評價。具體方法如下：

將經(jīng)過抑菌處理的絲綢制品試樣埋入瓜爾膠培養(yǎng)基中7天，觀察布面變化，并與對照樣進行對比。

1.3 抑霉菌檢測方法

參照標準：AATCC30-2004測試方法Ⅲ 瓊脂平碟，黑曲霉

試樣準備：真絲織物經(jīng)過生物抑菌劑處理后剪下直徑為3.8±0.5cm的圓片。

霉菌孢子液制備：

（1）取無菌水（含0.05%分散劑吐溫80）倒入培養(yǎng)好的斜面黑曲霉（Aspergillus niger）菌種中，采用無菌接種環(huán)輕刮菌種表面洗出孢子，把孢子液倒入含有玻璃珠的無菌三角瓶內(nèi)。

（2）用速度4 000r／min離心孢子液，去上清。用50mL無菌水洗滌沉淀后，再離心。用此法清洗3次。這種孢子液用無機鹽營養(yǎng)液稀釋，采用血球計數(shù)板測定孢子含量，孢子液含孢子1×106～5×106個／mL。

接種培養(yǎng)：用涂布棒將1.0±0.1mL的孢子液分散于含3%葡萄糖的無機鹽瓊脂表面，將圓片置于瓊脂表面。用吸管在每個圓片上均勻滴加0.2±0.01mL的孢子液。28±1℃，相對濕度RH≥95%的條件下培養(yǎng)7d。

1.4 抑細菌定性檢測方法

參照標準：GB／T20944.1-2007紡織品 抗菌性能評價瓊脂平皿擴散法

試樣準備：真絲織物經(jīng)過生物抑菌劑處理后剪下直徑d＝25±5mm的圓片。

細菌液制備：

（1）用接種環(huán)取保存菌，劃線接種至營養(yǎng)瓊脂平皿，37±1℃培養(yǎng)24h。

（2）挑取典型菌落接種于20mL營養(yǎng)肉湯內(nèi)，37±1℃，振動頻率110min-1，培養(yǎng)18～24h。

（3）用無菌蒸餾水20倍稀釋營養(yǎng)肉湯，調(diào)節(jié)菌濃度為1×108～5×108CFU／mL，作為試驗用菌液。

抑細菌試驗：

（1）準備下層培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂10mL／皿。

（2）準備上層培養(yǎng)基。1mL試驗菌液加入150mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，向（1）中的每個平皿傾注5mL，等其凝結(jié)。

（3）用無菌鑷子將實驗和對照樣貼到平皿中央，使試樣與瓊脂培養(yǎng)基很好地接觸。

（4）平皿37±1℃培養(yǎng)18～24h。

1.5 抑細菌定量檢測方法

參照標準為：GB／T20944.2-2007紡織品 抗菌性能評價 瓊脂平皿擴散法

試樣準備：真絲織物經(jīng)過生物抑菌劑處理后剪下18mm正方形，稱取0.40±0.05g作為一個試樣。進行高壓蒸汽滅菌（121℃，103KPa，15min）

抑細菌試驗：

（1）試樣接種：每小瓶的樣品準確接種0.2mL試驗菌液。

（2）接種后立即洗脫：在已接種試驗菌液的3個對照樣小瓶中，分別加入SCDLP培養(yǎng)基20mL，用振蕩器震蕩5次，5s／次，將菌洗下。

（3）將接種試驗菌液的其余小瓶（另外3個對照樣和A樣、B樣、C樣抑菌處理的真絲織物各3個）在37±1℃培養(yǎng)18～24h。

（4）培養(yǎng)后洗脫：培養(yǎng)后的小瓶按第2步驟的方法，分別將細菌洗下。

（5）菌落數(shù)測定：每個小瓶中取1mL洗脫液，使用稀釋液進行10倍系列稀釋，選取合適的稀釋度的溶液1mL注入平皿，再加45～50℃的計數(shù)平板培養(yǎng)基（EA）混勻，1個稀釋度做2個平皿。待培養(yǎng)基凝固后，在37±1℃培養(yǎng)24～48h。培養(yǎng)后，計數(shù)出現(xiàn)30～300個菌落平皿上的菌落數(shù)（CFU）。若最小稀釋度菌落數(shù)＜30，則按實際的數(shù)量記錄；若沒有菌落生長，菌落數(shù)記為“＜1”。

（6）結(jié)果處理

a.細菌數(shù)計算

式中：M—每個試樣細菌數(shù)；

Z—兩個平皿菌落數(shù)（CFU）平均值；

R—稀釋倍數(shù)；20—洗脫液用量（mL）。

b.試驗有效性判定

式中：F—對照樣的細菌增長值；

Ct—3個對照樣接種并培養(yǎng)后測得的細菌數(shù)平均值；

C0—3個對照樣接種后立即測得的細菌數(shù)平均值；

F≥1.5，試驗判定為有效；否則試驗無效，重新進行試驗。

c.抑菌率計算

抑菌率＝（Ct-Tt）／Ct×100%

式中：Tt—3個試樣接種并培養(yǎng)后測得的細菌數(shù)的平均值；

2 結(jié)果與分析

2.1 生物抑菌劑的篩選

為了快速選取具有最好抑菌效果的抑菌材料組成配方。我們采用植物膠營養(yǎng)基培養(yǎng)法對經(jīng)過生物抑菌劑處理的絲綢制品的抑菌效果進行前期評價，結(jié)果如表1。

表1 不同抑菌劑處理后的絲綢試樣抑菌效果

由實驗結(jié)果可以看出：處理劑2＃，4＃，5＃，7＃具有最好的抑菌效果。其中4＃是以大蒜素為主的抑菌材料，具有一定氣味不適合絲綢制品的抑菌處理。2＃處理劑是由苦參、黃芩、黃柏以及火麻仁等4種天然植物提取物配伍而成，5＃處理劑采用辣木籽、茯苓、苦參、黃芩、黃柏、地膚子、蛇床子、土槿皮以及山銀花等9種天然植物提取物配伍而成，7＃處理劑的組成和5＃相同，但7＃采用特殊技術(shù)進行了提取純化。

2.2 生物抑菌劑的抑菌效果評價

我們選取2＃、5＃、7＃抑菌處理劑（以下稱A樣、B樣、C樣）對其抑霉菌和細菌的效果進行詳細的研究。

2.2.1 生物抑菌劑抑霉菌效果評價

我們參照《AATCC30-2004測試方法Ⅲ 瓊脂平碟，黑曲霉》的檢測方法對我們通過前期快速抑菌檢測法篩選得到的生物抑菌劑進行了霉菌抑菌效果評價，結(jié)果如下。

圖1 抑菌培養(yǎng)結(jié)果（反面）

圖2 抑菌培養(yǎng)結(jié)果（正面，位置與上圖對應(yīng)）

表2 霉菌抑菌檢測結(jié)果

圖1，圖2以及表2為未經(jīng)抑菌處理和由抑菌劑A、B、C處理的真絲試樣在霉變實驗培養(yǎng)7d后霉菌生長情況表?？梢园l(fā)現(xiàn)：未經(jīng)過抑菌處理的絲綢樣布，經(jīng)過7d的霉菌培養(yǎng)，霉菌在樣布表面大量生長，肉眼可觀測并且覆蓋率達到100%，根據(jù)《AATCC-30紡織品的抗真菌能力評估：紡織品抵抗霉變和腐爛能力》標準，屬于“宏觀增長”的狀況。而由抑菌劑A、B處理的真絲樣布，霉菌在樣布表面有所生長但是覆蓋面積較未抑菌處理樣布大大減少，相比與未作抑菌處理的空白樣來說防霉效果已十分突出，表面覆蓋率均小于30%。而由抑菌劑C所處理的真絲織物，在顯微鏡下仍未見霉菌生長，對比未作抑菌處理的空白樣，其抑制霉菌生長的效果十分明顯。本實驗篩選所得到的抑菌劑具有良好的抑菌能力，能有效地抑制霉菌在真絲織物上生長的能力。

2.2.2 生物抑菌劑抑細菌效果定性評價

我們參照《GB／T20944.1-2007紡織品 抗菌性能評價瓊脂平皿擴散法》的檢測方法對我們通過前期快速抑菌檢測法篩選得到的生物抑菌劑進行了細菌抑菌效果定性評價。

2.2.2.1 抑菌圈寬度 H值測定

圖3為抗菌實驗抑菌帶，使用游標卡尺進行測定，H＝（D-d）／2，結(jié)果見表3。

式中 H——抑菌圈寬度，mm；

D——抑菌帶外徑的平均值，mm；

d——試樣直徑，mm。

圖3 抗菌實驗抑菌帶

表3 抗菌試驗抑菌帶寬度

2.2.2.2 細菌繁殖情況測定

抑菌帶測定后，用鑷子將試樣從培養(yǎng)基上移去，用顯微鏡檢查試樣接觸區(qū)域的細菌繁殖情況?？梢钥闯觯核性嚇酉戮鶡o細菌繁殖，見表4。

表4 抑菌效果評價

由試驗數(shù)據(jù)可知：對照樣抑菌帶寬度為0mm，證明對照樣不具有抑菌能力，而經(jīng)過抑菌劑C樣抑菌處理的試樣抑菌帶達到11.57mm（大腸桿菌）和17.17mm（金黃色葡萄球菌），抑菌劑A樣和B樣抑菌處理的試樣也都有明顯的抑菌帶，由此可以發(fā)現(xiàn)由本實驗制得的抑菌劑抑制細菌生長作用明顯。

2.2.3 生物抑菌劑抑細菌效果定量評價

我們參照《GB／T20944.2-2007紡織品 抗菌性能評價瓊脂平皿擴散法》的檢測方法對我們通過前期快速抑菌檢測法篩選得到的生物抑菌劑進行了細菌抑菌效果定量評價，見表5。

表5 抗菌試驗抑菌率

表6 抑菌效果評價

由試驗數(shù)據(jù)可知：經(jīng)抑菌處理的真絲織物，經(jīng)過兩種細菌培養(yǎng)后平均菌落數(shù)（CFU）基本均為零，抑菌率基本均為100%，顯示出了良好的抑菌效果。通過定性，定量兩種方法的分析均可證明由本實驗得到的抑菌劑抑制細菌生長作用明顯，其具有優(yōu)異的抗真絲織物上細菌生長的能力。

圖4 抑菌效果評價

3 結(jié)論

（1）通過快速抑菌檢測法篩選出辣木籽、茯苓、苦參、黃芩、黃柏、地膚子、蛇床子、土槿皮以及山銀花等9種成分復(fù)配的生物抑菌劑具有良好的抑制霉菌和細菌在真絲織物上生長的效果。

（2）通過霉菌細菌的培養(yǎng)試驗表明：所得到的生物抑菌劑具有良好的抑制霉菌和細菌在真絲絲綢織物上生長的能力。

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