流動注射法與分光光度法測定海水中亞硝酸鹽的含量

朱敬萍，梅光明，胡紅美，李鐵軍，顧蓓喬，陳 瑜，尤炬炬

（1.浙江海洋學院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021）

流動注射法與分光光度法測定海水中亞硝酸鹽的含量

朱敬萍1,2，梅光明1,2，胡紅美1,2，李鐵軍1,2，顧蓓喬1,2，陳 瑜1,2，尤炬炬1,2

（1.浙江海洋學院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021）

采用流動注射法和分光光度法測定海水中的亞硝酸鹽含量。通過實驗條件的優(yōu)化選擇，建立了流動注射儀最佳測定方法。兩種方法測定曲線線性范圍均為0～0.05 mg/L，相關系數(shù)均大于0.999；流動注射法和分光光度法的方法檢出限分別為0.002 6 mg/L和0.002 9 mg/L；在標準物質(zhì)和實際水樣測定中，二者測量結(jié)果基本一致，均具有較好的精密度和準確度；流動注射法在實際樣品測定加標回收率為83.0%～101.6%，相對標準偏差為0.29%～4.57%。因流動注射分析法具有快速、省時、方便、基體干擾小，精密度和準確性好等優(yōu)點，更適合批量樣品的測定。

海水；亞硝酸鹽；流動注射法；分光光度法

亞硝酸鹽是一類無機化合物的總稱，廣泛存在于土壤、天然水和食品中，是一種極為常見的污染物。亞硝酸鹽極不穩(wěn)定，可以被氧化而生成硝酸鹽，也極為容易被還原成氨，還可以與仲胺類反應生成亞硝胺類，這些物質(zhì)均具有強烈的致癌作用[1-2]。海水中亞硝酸鹽和硝酸鹽主要來自大陸徑流、沿岸排廢和其他氮化合物的分解與排放[3-4]。亞硝酸鹽含有豐富的氮肥，是藻類生長繁殖必需的營養(yǎng)物質(zhì)。在海水養(yǎng)殖的水體中，如果亞硝酸鹽含量低于0.1 mg/L，那么其對魚類一般不會造成明顯損害[5-6]；如果亞硝酸鹽氮的含量達到0.1～0.5 mg/L，就會產(chǎn)生明顯的中毒癥狀；當水體中亞硝酸鹽的含量高于0.5 mg/L時，中毒癥狀會明顯加劇，魚類的某些器官會出現(xiàn)衰竭現(xiàn)象，嚴重時會導致其死亡[7-8]。因此海水中亞硝酸鹽類含量是反應海水水質(zhì)好壞的一個重要指標之一。為及時了解海洋生態(tài)環(huán)境狀況和保持漁業(yè)養(yǎng)殖安全，有必要周期性地對某些特定水域的海水進行取樣調(diào)查，以期了解水質(zhì)狀況，制定切實有效的治理與保護措施。目前亞硝酸鹽含量的測定主要采用離子色譜法、極譜法、萘乙二胺分光光度法、催化光度法和熒光法[等[9-10]，前兩種方法所需儀器價格昂貴，后三種方法普遍存在靈敏度低，操作繁瑣，分析速度慢等缺點。近年來，運用流動注射分析的方法，測定海水中亞硝酸鹽含量得到迅速的發(fā)展[11-12]，流動注射儀測定方法具有快速(可在1 h內(nèi)完成50個樣品測定)、靈敏度高、準確性好的優(yōu)點。且儀器流路簡單，試劑用量少，操作簡便，對實際水樣的測定效果良好。本研究對流動注射法測定海水中亞硝酸鹽含量的測定條件進行了優(yōu)化，并與紫外可見分光光度法與流動注射法進行分析對比。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；AA3流動注射分析儀（德國SEAL Analytical公司）；圖1為亞硝酸鹽分析模塊流路圖。

圖1 亞硝酸鹽分析模塊流路圖Fig.1 The route map of nitrite

1.2 試劑

亞硝酸鹽標準貯備溶液（100 mg/L，國家標準物質(zhì)中心)；所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

磺胺溶液：(10 g/L)稱取5 g磺胺，溶于350 mL鹽酸溶液（1+6），用純水稀釋至500 mL，盛于棕色試劑瓶中，冰箱保存。

鹽酸萘乙二胺溶液（NEDD）：1 g/L，稱取0.5 g鹽酸萘乙二胺，溶于500 mL純水中，儲存于棕色瓶中，冰箱保存。

顯色劑：將100 mL優(yōu)級純磷酸加入約700 mL去離子水中，加入10.0 g磺胺，完全溶解后，再加入0.50 g NEDD和4mL的聚氧乙烯月桂醚溶液（Brij-35，30%），稀釋至1000 mL，并混合均勻，儲存于棕色瓶中，冷藏。

1.3 樣品采集與預處理

于2011年7月和11月分別在舟山岱衢洋增殖放流海域、樂清灣泥蚶國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)、洞頭海域海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)特定水域以及從東極島中間山海海域采集水樣（表1）。用采水器采集各站位的水樣，帶回實驗室經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。應從速分析，如不能從速分析，需放置冷藏室保存。

表1 浙江沿岸海域水質(zhì)監(jiān)測采集點Tab.1 The list of water quality monitoring points in Zhejiang coastal waters

1.4 實驗方法

1.4.1 分光光度法（萘乙二胺分光光度法）

1）方法原理：在酸性介質(zhì)中亞硝酸鹽與磺胺進行重氮化反應，其產(chǎn)物再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色偶氮染料，于543 nm波長處測定吸光度。方法檢出限為0.003 mg/L。

2）繪制標準曲線：取6個50 mL容量瓶，分別移入0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL亞硝酸鹽標準使用液（濃度為5.0mg/L），加純水至標線，混勻，使標準系列濃度分別為：0.0，0.010，0.020，0.030，0.040，0.050mg/L。各加入1.0 mL磺胺溶液，混勻后放置5 min，再各加入1.0 mL鹽酸萘乙二胺溶液混勻。放置15 min后，在543 nm波長、3 cm測定池下比色測定，以去離子水作參比，測定其吸光值。

1.4.2 連續(xù)流動分析法

1）方法原理：亞硝酸鹽在酸性條件下與對氨基苯磺酰胺反應生成一個偶氮化合物，然后與萘乙二胺鹽酸反應生成紫紅色化合物在550 nm波長下檢測。方法檢出限為0.003 mg/L。

2）繪制標準曲線：根據(jù)樣品濃度的高低配制亞硝酸鹽標準系列。本研究中流動注射法采用與分光光度法一致的標準曲線范圍（0～0.05 mg/L）。

3）儀器測定條件：連接試劑、純水和試樣。打開AA3流動注射分析儀和工作軟件，鍵入實驗參數(shù)：選通道、杯續(xù)杯數(shù)、樣品數(shù)；進樣/沖洗：1.5；平滑：16；基線校正：自動基線參比(%)10；運行延遲時間(min)：6.0。

4）啟動AA3流動分析儀，加熱池(37℃)，泵入純水至基線穩(wěn)定后，再泵入試劑到進樣通道，達到試劑基線穩(wěn)定；測定標準曲線，要先測一下標準濃度的最高點，最佳峰高為75%～95%之間，設定它的增益點。然后開始自動分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 條件試驗的優(yōu)化選擇

對于流動注射法的條件優(yōu)化，研究了各流路(試劑和載流)流速對峰高的影響,在流速為0.20～2.00mL/min范圍內(nèi)，經(jīng)過反復試驗，試劑流速為0.80 mL/min，載流流速為1.20 mL/min時，峰最高；因此，選擇試劑流速為0.80 mL/min，載流流速為1.20 mL/min。對進樣體積在0.2～1.2 mL時對峰高的影響進行反復試驗，結(jié)果表明峰高隨進樣體積增大緩慢增加，為提高檢測分析速度，試驗采用進樣體積0.5 mL。在上述實驗條件下，適當?shù)慕档土魉倏梢詼p少試劑消耗，并且可以反應完全，不用擔心擴散和帶過。在反應條件下，樣品和試劑的流速可能會發(fā)生變化，試劑的濃度、室內(nèi)和反應溫度等會變化，但因為樣品和標準經(jīng)過同樣的過程并達到穩(wěn)態(tài)，所以它們的變化不會對結(jié)果準確性產(chǎn)生影響。

2.2 磷酸濃度的優(yōu)化

顯色劑中磷酸用量對峰高同樣產(chǎn)生很大的影響，本實驗在1 L顯色劑中加入磷酸的體積分別為50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL，結(jié)果表明添加體積為50～100 mL，吸光度值趨上升趨勢，100 mL時吸光度值達到最大，而磷酸加入量超過100 mL后，吸光度值下降很快，因此，選用100 mL為最佳加入量。如果出現(xiàn)靈敏度低或線性不好，要通過實驗來調(diào)整試劑的濃度。確保良好的重現(xiàn)性和低檢出限，保證反應環(huán)境的小變化不會影響結(jié)果。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

用流動注射法和分光光度法制作亞硝酸鹽測定的標準曲線分別見圖2和圖3所示。結(jié)果表明：在上述已優(yōu)化好的測量條件下，流動注射法和分光光度法在0～0.05 mg/L測定范圍內(nèi)，吸光度值與濃度均呈良好的線性關系，線性回歸方程分別為y=9. 1146E-007和y=10.26C-0.0019(C、E單位為mg/L，y為吸光值），相關素數(shù)R均大于0.999，能滿足分析檢測要求。用統(tǒng)計測量法對空白溶液連續(xù)測定15次，得出流動注射法和分光光度法的方法檢出限分別為0.0026 mg/L和0.0029 mg/L

圖2 分光光度法標準曲線Fig.2 Standard curve of spectrophotometric analysis

圖3 流動注射法標準曲線Fig.3 Standard curve of flow injection analysis

2.4 精密度和準確度

以標準物質(zhì)編號為GSBZ 200619和GSBZ 200624樣品進行平行各6次測定，檢測結(jié)果見表2。

表2 標準物質(zhì)參比值Tab.2 The standard material's reference value

從表中可知，通過優(yōu)化好的測量條件，經(jīng)AA3流動注射分析儀和分光光度法測定亞硝酸鹽標準物質(zhì)，均在標準值范圍內(nèi)。流動注射法測得的相對標準偏差在0.044%～0.691%之間，分光光度法的相對標準偏差在0.278%～1.119%之間，說明流動注射法與分光光度法均具有較好的精密度和準確度，符合分析要求。

2.5 海水樣品檢測結(jié)果及加標回收率實驗

本研究對舟山岱衢洋、樂清灣、洞頭、中間山海附近海域采集樣品，將水樣過濾后進行分析，同時采用流動注射法和分光光度法進行測定，并采用標準加入法，在樣品中添加標準溶液后用流動注射法平行測定6次，進行加標回收試驗，分析結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果Tab.3 The results of the samples

由上表可知，流動注射分析儀測定結(jié)果與分光光度法手動測量結(jié)果基本一致，樣品的加標回收率在83.0%～101.6%之間，相對標準偏差在0.29%～4.57%，具有較好的準確度。相對標準偏差均小于5.0%，符合《GB17378.4-2007海洋監(jiān)測規(guī)范》中要求RSD≤10%的規(guī)定要求[13]。結(jié)果表明流動注射法有較好的精密度和準確度，符合國標的檢測要求。

3 小結(jié)

本研究采用分光光度法和流動注射法測定海水中的亞硝酸鹽含量，對流動注射法的試驗條件選擇進行優(yōu)化，建立了最佳測定方法。在標準物質(zhì)和實際水樣測定中，二者測量結(jié)果基本一致，均具有較好的精密度和準確度。因流動注射分析法具有快速、省時、方便、基體干擾小，精密度和準確性好等優(yōu)點，更適合批量樣品的測定。參考文獻：

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[13]GB17378.4-2007海洋監(jiān)測規(guī)范[S]．

Determination of Nitrite in Seawater by the Flow Injection Method

ZHU Jing-ping1,2,MEI Guang-ming1,2,HU Hong-mei1,2,et al
(1.Institute of Marine and Fisheries of Zhejiang Ocean University,Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Key Lab of Mariculture and Enhancement of Zhejiang province,Zhoushan 316021,China)

The present study introduced the experiment method of determining nitrite in seawater by flow injection and spectrophotometric method.Through the optimization of the experimental conditions,the optimum flow injection method was given.The linear range of determination standard curve for the two methods was 0-0.05 mg/L,with the correlation coefficients all above 0.999.The detection limits were 0.002 6 mg/L and 0.002 9 mg/L, respectively for flow injection method and spectrophotometric method.In determinations of the standard substances and actual samples,the two methods gave the consistent measurement results and both had good precision and accuracy.The recoveries of spiking samples in flow injection analysis were 83.0%-101.6%,and the relative standard deviations were 0.29%-4.57%.With the advantages of fast,time-saving,convenient,little interference and better precision and accuracy,the flow injection analysis method is more suitable for assaying mass samples.

sea water;nitrite;flow injection method;spectrophotometric method

X832

A

1008－830X(2015)01－0050－04

2014-10-30

浙江省重大科技成果專項計劃項目（2012C13005）；浙江省科技計劃項目（2013F10065）

朱敬萍（1960-），女，山東滕州人，高級工程師，研究方向：水域環(huán)境及食品安全分析.E-mail:ZJP669888@163.com

顧蓓喬（1963-），男，上海市人，研究方向：水域環(huán)境及食品加工.E-mail:gbq@zjou.edu.cn