新斯的明拮抗銀環(huán)蛇毒素對(duì)大鼠膈肌張力的影響

陳少英 李 燕 梁子敬* 梁 慶 劉 榮

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東廣州510120;2廣東省中醫(yī)院急診科，廣東廣州，510120)

銀環(huán)蛇毒主要以神經(jīng)毒素為主，包含多種成分，毒性強(qiáng)，中毒者常因神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯表現(xiàn)為橫紋肌無力，嚴(yán)重者可因呼吸肌肉呈弛緩性癱瘓而無力出現(xiàn)呼吸停止，導(dǎo)致窒息死亡。臨床上應(yīng)用新斯的明拮抗銀環(huán)蛇引起的肌無力存在爭(zhēng)議且缺乏隨機(jī)對(duì)照研究［1，2］，國(guó)內(nèi)外有離體實(shí)驗(yàn)證明新斯的明對(duì)銀環(huán)蛇的成分毒所致的肌無力有拮抗作用，但療效不確定［3，4］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用新斯的明干預(yù)經(jīng)銀環(huán)蛇毒處理過的膈肌肌條，通過記錄離體膈肌肌條張力大小，以探討新斯的明對(duì)銀環(huán)蛇毒處理后的膈肌收縮性的早期影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

銀環(huán)蛇粗毒(南昌農(nóng)大特種動(dòng)物蛇類養(yǎng)殖場(chǎng))，甲硫酸新斯的明注射液(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字:H31022770)，氯化乙酰膽堿(阿拉丁試劑公司)，苛氏液(pH 7.4)組成(mmol/L)［4］:NaCl(118);KCl(4.8);KH2PO4(1.2);CaCl2(2.5);NaHCO3(25);MgSO4(2.4)and D-(+)glucose(11)，溶解于去離子水。試劑購(gòu)置于阿拉丁試劑公司。成年SPF級(jí)SD雌性大鼠，購(gòu)置于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，體質(zhì)量為200～220 g，共24只。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)大鼠均經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，分別與腹腔、胸腔分離并取出膈肌后立即浸入通有混合氣(95%O2，5%CO2)的苛氏液中。去除膈肌周圍的殘留血液、脂肪組織等后，將膈肌沿肌纖維方向分離制成實(shí)驗(yàn)用肌條(1 cm×1.5 cm)，肌條一端用絲線固定并連于高精度張力換能器(JZ300型，北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)上，通過橋式放大器由8導(dǎo)生理記錄儀記錄張力改變情況，后由Labchat 7軟件分析并顯示肌條張力大小。另一端固定于固定桿上并使整個(gè)肌條浸于麥?zhǔn)喜壑?，槽中液體為苛氏液，容積為10 mL，且持續(xù)通入混合氣，溫度維持37℃。整個(gè)準(zhǔn)備過程中，注意實(shí)驗(yàn)用肌條不能過度牽拉。調(diào)節(jié)膈肌肌條前負(fù)荷為1 g［4］，平衡45 ～60 min，每15 分鐘更換苛氏液。平衡后用10－4mmol/L濃度［5］的乙酰膽堿刺激，待再次達(dá)到平衡后，給予銀環(huán)蛇粗毒毒素(濃度:5μg/mL)，5 min后沖洗并給予不同濃度的新斯的明(1、3、10 μmol/L)或生理鹽水(對(duì)照組)，記錄不同時(shí)間段(5、10、15、30、60 min)膈肌肌條張力(g)大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組比較采用單因素方差分析，選擇dunnetts檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組肌條在不同時(shí)間段的影響見圖1及表1:①5 min:1、3、10μmol/L濃度新斯的明較對(duì)照組的肌力恢復(fù)均不明顯，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);②10 min:1、3μmol/L濃度新斯的明較對(duì)照組的肌力均有恢復(fù)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。10μmol/L濃度新斯的明較對(duì)照組的肌力恢復(fù)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。③15和30 min:1、3、10μmol/L濃度新斯的明的肌力均有恢復(fù);其中只有10μmol/L組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨新斯的明濃度增加，肌力恢復(fù)程度增加。10μmol/L比1和3μmol/L兩組差異明顯。④60 min:1、3、10μmol/L濃度新斯的明的肌力均有恢復(fù);其中3、10μmol/L組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且隨新斯的明濃度增加，肌力恢復(fù)程度增加。不同濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組不同時(shí)間段肌張力變化(g)

3 討論

銀環(huán)蛇毒含有含多種多肽成分，具有不同的生物學(xué)活性［6］。目前已知其蛇毒主要含有α-銀環(huán)蛇毒和β-銀環(huán)蛇毒，這兩種毒素統(tǒng)稱為“銀環(huán)蛇毒”。此外，銀環(huán)蛇毒還含有 Candoxin［4］、P-銀環(huán)蛇毒［7］、κ-銀環(huán)蛇毒(κ-BGT)、γ-銀環(huán)蛇毒(γ-BGT)、磷脂酶A［8］和心臟毒素(cardiotoxin)［9］等。各種毒素作用機(jī)制及毒性各不相同，最終導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯［10-12］。中毒者常表現(xiàn)為橫紋肌無力，嚴(yán)重者可因膈肌無力出現(xiàn)呼吸停止，是急診的一種常見危重急癥。目前國(guó)際公認(rèn)的治療蛇咬傷的方法是應(yīng)用抗蛇毒血清及快速清除毒素分子等，但鑒于抗蛇毒血清保存難、過敏、無特異性抗蛇毒血清等原因，抗蛇毒血清的應(yīng)用尚不易普及。而且蛇咬傷的患者常為山區(qū)者，因醫(yī)療資源受限，往往在蛇咬傷之后不能馬上使用抗蛇毒血清，故尋求更多的治療方式，既可以盡早、便捷、安全、廣泛的使用，又可以為蛇咬傷患者爭(zhēng)取救治時(shí)間就顯得十分必要。新斯的明是醫(yī)保和農(nóng)合基本用藥，如證明有效，可在社區(qū)和廣大農(nóng)村、山區(qū)廣泛推廣，爭(zhēng)取時(shí)間送有條件救治毒蛇傷的醫(yī)院進(jìn)一步搶救治療，從而提高搶救成功率，減少致殘率和死亡率。

表1 不同時(shí)間段各組肌力恢復(fù)情況 (gˉ±s)

表1 不同時(shí)間段各組肌力恢復(fù)情況 (gˉ±s)

注 :與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與1μmol/L組比較，#P ＜0.05;與3 μmol/L組比較，△P ＜0.05

組別 n 8 ±0.019 0.860 ±0.024 1 μmol/L 組 n=6 0.853 ±0.027 0.860 ±0.033 0.870 ±0.033 0.870 ±0.029 0.883 ±0.031 3 μmol/L 組 n=6 0.853 ±0.024 0.863 ±0.030 0.873 ±0.024 0.888 ±0.036 0.908 ±0.032*10 μmol/L 組 n=6 0.858 ±0.013 0.912 ±0.026# 0.920 ±0.025*# 0.932 ±0.013*# 0.954 ±0.015*#△5 min 10 min 15 min 30 min 60 min對(duì)照組 n=6 0.846 ±0.019 0.844 ±0.023 0.846 ±0.033 0.84

目前發(fā)現(xiàn)以肌無力為癥狀的重癥肌無力、手術(shù)中使用肌松劑等疾病中，其病機(jī)均為神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯，與銀環(huán)蛇毒中毒機(jī)制非常相似。臨床對(duì)于重癥肌無力、使用肌松劑的患者采用膽堿酯酶抑制劑(如:新斯的明)治療且療效明確［13-14］，更有相關(guān)使用劑量、時(shí)機(jī)等深入研究［15-16］。國(guó)內(nèi)外也曾對(duì)新斯的明拮抗不同類型的銀環(huán)蛇毒(成分毒素)所致肌無力進(jìn)行研究，結(jié)果表明其影響不確定［3-4］。呼吸活動(dòng)的強(qiáng)度是由膈肌等吸氣肌和腹肌等呼氣肌的活動(dòng)共同決定［17］，本實(shí)驗(yàn)通過觀察膈肌的張力，明確新斯的明拮抗銀環(huán)蛇毒所致膈肌無力的影響。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)各組中，隨著時(shí)間的推移，肌力均有不同程度的恢復(fù)，但在60min時(shí)尚未有肌力完全恢復(fù)的情況。曾有對(duì)比實(shí)驗(yàn)［5］，用一定濃度的新斯的明拮抗不同類型的蛇毒所致的肌肉無力，結(jié)果表明Candoxin的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)功能能快速而且完全恢復(fù)，而 α-BGT的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)功能在180min后完全沒有恢復(fù)。不同時(shí)間段各組張力不同程度的恢復(fù)，可能原因是部分毒素(例如:Candoxin)從突觸后受體清除使得部分的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)功能恢復(fù)。但60 min時(shí)毒素尚未完全清除，或許是部分毒素(例如 α-BGT)與突觸后受體不可逆結(jié)合所致和(或)毒素作用的清除需要更多的時(shí)間(毒素的清除具有時(shí)間依賴性)。

加入新斯的明的各組均有不同程度的神經(jīng)肌肉功能恢復(fù)，可能有以下原因:新斯的明抑制了乙酰膽堿的分解，使得突觸間隙中乙酰膽堿的含量升高，從而高濃度乙酰膽堿有利于與毒素競(jìng)爭(zhēng)性地和受體結(jié)合，使得神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)功能得到不同程度的恢復(fù)。另高濃度的乙酰膽堿增加了占有原來空閑的乙酰膽堿受體的可能性，加強(qiáng)了神經(jīng)肌肉功能的傳導(dǎo)。故整體表現(xiàn)出新斯的明增加了神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，使得膈肌肌條張力恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)中，10μmol/L新斯的明組拮抗效果明顯優(yōu)于1、3μmol/L新斯的明組，提示新斯的明的拮抗效果與其濃度有一定的相關(guān)性。既往關(guān)于肌松劑筒箭毒堿的研究表明:從數(shù)字上講，如果筒箭毒堿劑量是雙倍的，乙酰膽堿濃度必須是4倍才能夠與筒箭毒堿相競(jìng)爭(zhēng)［18］。結(jié)合以上研究結(jié)果，考慮10 μmol/L新斯的明較1、3μmol/L新斯的明拮抗效果明顯是因?yàn)?在神經(jīng)肌肉接頭處，新斯的明通過抑制膽堿酯酶使突觸間隙的乙酰膽堿含量增加，從數(shù)量上講，10μmol/L新斯的明能產(chǎn)生更多的乙酰膽堿，使其與實(shí)驗(yàn)中5μg/mL銀環(huán)蛇毒相競(jìng)爭(zhēng)。而1及3μmol/L新斯的明組產(chǎn)生的乙酰膽堿含量未能與5 μg/mL銀環(huán)蛇毒產(chǎn)生明顯的競(jìng)爭(zhēng)性。

已有的研究表明:達(dá)到最大效應(yīng)劑量前，大劑量的膽堿酯酶抑制劑應(yīng)該比小劑量的膽堿酯酶抑制劑的拮抗作用更加迅速和完全。但是超過最大效應(yīng)劑量之后，再加大劑量也不會(huì)產(chǎn)生進(jìn)一步的拮抗作用。對(duì)新斯的明來說，最大劑量在60～80μg/kg之間。Donati等［19］研究了筒箭毒堿90%阻滯麻醉的恢復(fù)情況，證明了新斯的明的劑量與恢復(fù)速度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新斯的明由5μg/kg增加到50μg/kg時(shí)，早期其拮抗作用不斷增強(qiáng)，但后期50μg/kg的新斯的明，肌肉顫搐值只達(dá)到正常的80%。另臨床過量應(yīng)用新斯的明可能會(huì)導(dǎo)致“膽堿能危象”。表現(xiàn)為大汗、瞳孔縮小、前額痛、激動(dòng)不安、心動(dòng)過緩、低血壓、肌肉震顫、心悸、支氣管收縮伴分泌增加、喘鳴等。最后肌無力加重、大小便失禁、驚厥、昏迷，嚴(yán)重者可因心跳停止、中樞性呼吸麻痹和肺水腫而死亡。綜合考慮新斯的明在拮抗銀環(huán)蛇毒所致肌無力時(shí)，其濃度并非越高越好，所以尋找更為合適的新斯的明的濃度可以成為以后研究的新方向。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示新斯的明拮抗銀環(huán)蛇毒所致膈肌無力的作用明確，且療效與劑量有相關(guān)性。但有關(guān)新斯的明拮抗銀環(huán)蛇毒所致膈肌無力的時(shí)機(jī)、療程等實(shí)際臨床效應(yīng)，尚需更多的研究論證。

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