HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)

王 玲，趙衛(wèi)東

HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)

王 玲1，2，趙衛(wèi)東1

目的探討低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及VEGF受體（VEGFR-1、VEGFR-2）在稽留流產(chǎn)（MA）絨毛組織中的表達(dá)及臨床意義，探究MA發(fā)生中低氧對(duì)腦血管生成的影響。方法免疫組化SP法檢測(cè)35例MA患者（研究組）以及32例正常早孕行人工流產(chǎn)者（對(duì)照組）絨毛組織的HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表達(dá)水平，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果研究組與對(duì)照組絨毛組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2均有表達(dá)。研究組中HIF-1α表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），VEGF、VEGFR-2表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2表達(dá)呈正相關(guān)性（P＜0.05），研究組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與VEGFR-1表達(dá)無相關(guān)性。結(jié)論 HIF-1α在MA絨毛組織中表達(dá)上升，通過調(diào)節(jié)VEGF、VEGFR-2基因的轉(zhuǎn)錄，胎盤絨毛血管的生成減少，可能是MA發(fā)生的重要原因。

稽留流產(chǎn)；低氧誘導(dǎo)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體

稽留流產(chǎn)（missed abortion，MA）也稱過期流產(chǎn)，是指妊娠20周之前胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出，是自然流產(chǎn)的一種特殊類型。引起MA的原因眾多，但確切機(jī)制尚不明確。在早期妊娠中絨毛膜的絨毛血管化與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，在此過程中血管的缺陷會(huì)導(dǎo)致一些并發(fā)癥。在妊娠早期，胚胎的發(fā)育和胎盤的形成是在一個(gè)相對(duì)低氧的情況下完成的，低氧對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)的侵襲和分化過程起重要的調(diào)節(jié)作用［1］。許多調(diào)節(jié)因子如低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGF受體（vascular endotheli-al growth factor receptor-1、2，VEGFR-1、VEGFR-2）與早孕胎盤血管的生成和發(fā)展關(guān)系密切。該研究檢測(cè)MA患者絨毛組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2分子的表達(dá)情況及相互關(guān)系，從血管生成的角度對(duì)MA的發(fā)生進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2013年6月～2013年12月在安徽省婦幼保健院婦科住院的MA患者35例為研究組，孕婦年齡20～35（29.40±4.52）歲，孕周7～10（8.40±2.34）周。篩選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～35歲，胚胎停止發(fā)育的時(shí)間在停經(jīng)7～10周；②TORCH檢測(cè)、抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA）、抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、抗子宮內(nèi)膜抗體（endomethal antibody，ENA）檢測(cè)均為陰性；③本次妊娠期間未服用保胎藥物，無毒物接觸史；④無原發(fā)性高血壓、糖尿病、慢性腎炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等病史；⑤宮頸分泌物檢查支原體、衣原體為陰性。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)B超及β-hCG動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)證實(shí)為MA。選取因非意愿妊娠在本院門診要求行人工流產(chǎn)的早孕婦女32例為對(duì)照組，孕婦年齡21～36（28.30±5.53）歲，孕周7～10（7.90±2.16）周。篩選標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)規(guī)律，獲取標(biāo)本前3個(gè)月未使用過甾體類激素，無異常孕育史，無原發(fā)性高血壓、糖尿病、慢性腎炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等病史。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)B超檢查提示其為宮內(nèi)妊娠，可見胚胎心管搏動(dòng)，但其要求行“人工流產(chǎn)”的健康孕婦。兩組患者的年齡、孕產(chǎn)次差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)研究對(duì)象知情同意并簽字。

1.2 標(biāo)本的采集及處理在無菌條件下采用負(fù)壓（53.3～66.7 kPa）抽吸方法吸出的絨毛組織，迅速在生理鹽水中漂洗后，放入10%甲醛固定液固定24 h，石蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片，黏附于防脫臘的載波片。按試劑盒說明書檢測(cè)HIF-1α、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的表達(dá)。常規(guī)HE染色法觀察兩組絨毛及血管形態(tài)。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法采用免疫組化SP法，按照試劑盒說明書操作。采用辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素免疫組化法。4 μm厚切片，60℃烤箱過夜后脫蠟至水，酒精梯度脫水后蒸餾水洗；加入檸檬酸抗原高壓修復(fù)，高壓鍋冒汽后2 min，室溫冷卻，3%的過氧化氫溶液封閉10 min；加一抗抗體，4℃冰箱過夜，PBS沖洗；加生物素標(biāo)記的二抗，PBS沖洗；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹脂封片。用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑兔抗人單克隆抗體HIF-1α、兔抗人單克隆抗體VEGF、兔抗人單克隆抗體VEGFR-2原液、三部法免疫組化試劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司；兔多克隆抗體VEGFR-1原液購(gòu)自武漢博士德公司。

1.5 結(jié)果判定每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（× 400），鏡下見黃色顆粒為陽性細(xì)胞，陽性產(chǎn)物應(yīng)分布于細(xì)胞質(zhì)。依照細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量）可分為：無著色（0分），淡黃色顆粒（1分），淺褐色顆粒（2分），深褐色顆粒（3分）。著色細(xì)胞數(shù)以每張切片陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示：沒有陽性細(xì)胞（0分），＜10%（1分），11%～50%（2分），51%～80%（3分），＞80%（4分）。采用積分綜合計(jì)量，計(jì)算公式為：總數(shù)值＝著色強(qiáng)度×著色細(xì)胞數(shù)；整個(gè)得分從0～12分，根據(jù)最終得分結(jié)果分為3個(gè)等級(jí)：0分，無反應(yīng)；1～4分，低表達(dá)；＞4分，高表達(dá)。至少隨機(jī)觀察5～10個(gè)高倍鏡視野［2］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析，計(jì)量資料同一因子組間的比較采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析，蛋白表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)方法，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪制相關(guān)統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對(duì)照組臨床特征χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析兩組患者年齡、孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究組陰道流血明顯多于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究組既往有妊娠史多于對(duì)照組，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 臨床特征

2.2 兩組絨毛組織中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)情況采用t檢驗(yàn)分析表達(dá)情況，HIF-1α在兩組絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核、血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在研究組表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGF、VEGFR-2在兩組絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及周圍間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在研究組中明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGFR-1在兩組絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，兩組中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、2，表2。

2.3 HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)方法分析相關(guān)性，對(duì)照組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)呈正相關(guān)性（P＜0.05）。研究組中HIF-1α與VEGFR-2呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與VEGFR-1無明顯相關(guān)性。見表3、4。

表2 兩組中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)比較（±s）

表2 兩組中HIF-1α、VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)比較（±s）

因子對(duì)照組（n＝32）研究組（n＝35）t值P值HIF-1α2.57±0.423.57±0.852.160.043 VEGF6.14±0.713.14±1.182.470.019 VEGFR-12.24±0.402.31±0.270.930.360 VEGFR-24.04±0.501.85±0.393.180.003

表3 對(duì)照組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

HIF是一種異質(zhì)二聚體蛋白，由α亞基和β亞基構(gòu)成。HIF-1α常氧條件下經(jīng)過泛素蛋白水解途徑降解，低氧環(huán)境下其降解過程受抑制，HIF-1α蛋白迅速累積，并與HIF-1β聚合，形成有活性的HIF-1蛋白，調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄［3］。HIF-1α特異性作用于低氧反應(yīng)通路，調(diào)節(jié)活性。研究［4］表明HIF-1α可以通過誘導(dǎo)血管生成而發(fā)揮作用。本研究顯示在研究組及對(duì)照組絨毛組織中HIF-1α均有表達(dá)，提示早孕低氧下HIF-1α發(fā)揮了重要作用。研究［5］表明，HIF-1α上升引起滋養(yǎng)細(xì)胞分化為侵入型受抑制，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮螺旋動(dòng)脈變淺，胎盤血管灌注減少引起妊娠失敗。本研究表明HIF-1α在MA中表達(dá)上升，可能與MA中嚴(yán)重低氧誘導(dǎo)HIF-1α有關(guān)。

表4 研究組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)相關(guān)性分析

VEGF被認(rèn)為是最強(qiáng)大的血管生成啟動(dòng)子，VEGFR-1、VEGFR-2是VEGF的兩個(gè)高親和力受體；VEGFR-2是血管生成主要因子，與VEGF結(jié)合后發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。研究［6］顯示，敲除VEGFR-1基因的小鼠胚胎，內(nèi)皮細(xì)胞過度增生，血管官腔阻塞，形成過多無功能血管，胚胎死亡，提示VEGFR-1具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。早孕時(shí)血管生成的正負(fù)因子處于平衡狀態(tài)，這個(gè)平衡促進(jìn)血管的生成并維持正常的妊娠。妊娠早期胎盤血管的形成在VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2的指導(dǎo)下進(jìn)行［7］，研究［8］也表明早孕胎盤絨毛中VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2在血管生成中起作用。本研究中研究組和對(duì)照組絨毛組織中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2都有表達(dá)，且研究組中的VEGF、VEGFR-2表達(dá)明顯低于對(duì)照組，提示MA中血管生成的正性因子受到抑制，負(fù)性因子無明顯改變，導(dǎo)致胎盤血管生成減少引起妊娠失敗。研究［9］表明，MA中VEGF、VEGFR-2表達(dá)明顯下降。

本研究中對(duì)照組絨毛組織中HIF-1α與VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2呈正相關(guān)性，表明低氧通過HIF-1α上調(diào)VEGF表達(dá)，胎盤絨毛血管網(wǎng)絡(luò)逐漸形成并促進(jìn)妊娠的繼續(xù)。研究組中HIF-1α與VEGF、VEGFR-2呈負(fù)相關(guān)性，與VEGFR-1無明顯的相關(guān)性。研究［10］表明，MA中HIF-1α表達(dá)上升，VEGF下降，HIF-1α與VEGF呈負(fù)相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致。為VEGF引起MA的關(guān)鍵作用的假設(shè)提供了支持。推測(cè)在MA這個(gè)嚴(yán)重低氧的環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)上升，HIF-1α可能抑制了VEGF的表達(dá)，血管生成的平衡被打破，正性因子減少，負(fù)性因子無明顯改變，胎盤絨毛血管生成減少，早期胚胎不能獲得足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致MA的發(fā)生。

綜上所述，低氧程度不同造成HIF-1α、VEGF、 VEGFR-1、VEGFR-2之間關(guān)系失衡引起血管發(fā)育的異?？赡苁窃斐蒑A的重要原因。MA中HIF-1α引起VEGF、VEGFR-2升高的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，明確MA病因并盡早診斷治療。

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The expression and significance of HIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 in missed abortion patients

Wang Ling1，2，Zhao Weidong1
（1Dept of Obstetrics and Gynaecology，The Affiliated Provincial Hosptial of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Obstetrics，Anhui Province Maternity and Child Care，Hefei 230001）

ObjectiveTo study the expressions and clinical significance of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α），vascular endothelial growth factor（VEGF），vascular endothelial growth factor receptor-1（VEGFR-1）and vascular endothelial growth factor receptor-2（VEGFR-2）in the villi tissue of patients with missed abortion（MA）and early pregnant women.To explore the influence of hypoxia on placenta angiogenesis in missed abortion.MethodsTo detect the expression of HIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 in the villi tissue of 35 cases of MA patients（research group）and 32 early pregnant women（control group）who underwent induced abortion surgery by immunohistochemistry，and theResultswere statistical analysis.ResultsHIF-1α，VEGF，VEGFR-1 and VEGFR-2 were expressed both in the villi tissue of research group and the control group.The expression of HIF-1α was higher in the research group than in the control group（P＜0.05）.The expressions of VEGF，VEGFR-2 were significantly lower in the research group than in the control group（P＜0.05）；the expression of HIF-1α was positively correlated with VEGF，VEGFR-1and VEGFR-2 in the control group，and the expression of HIF-1α was negatively correlated with VEGF and VEGFR-2 in the research group（P＜0.05），which had no correlation with VEGFR-1.ConclusionThe expression of HIF-1α in the villi tissue of MA is up-regulated，the blood vessel formation of placenta decreases by adjusting the VEGF and VEGFR-2 genes transcription，which maybe is the important causes for MA.

HIF-1α；VEGF；VEGFR-1；VEGFR-2；missed abortion

R 714.21

1000－1492（2015）02－0227－05

2014－11－13接收

安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：08010302101）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 2300012安徽省婦幼保健院產(chǎn)科，合肥 230001

王 玲，女，碩士研究生；趙衛(wèi)東，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：victorzhao＠163.com