PPARγ在絨毛組織中的表達與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系

陳 果，程玲慧，劉 波，周曙光

PPARγ在絨毛組織中的表達與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系

陳 果1，2，程玲慧1，劉 波2，周曙光2

目的研究過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）蛋白在正常早孕及早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中的差異表達，探討PPARγ與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化PV兩步法、Western blot法檢測PPARγ蛋白在正常早孕婦女（對照組，n＝40）和早期自然流產(chǎn)患者（實驗組，n＝40）絨毛組織中的表達。結(jié)果免疫組化顯示PPARγ蛋白主要在兩組絨毛組織中細胞滋養(yǎng)層細胞及絨毛外滋養(yǎng)層細胞中表達；Western blot法顯示PPARγ蛋白在實驗組絨毛組織中的表達較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論PPARγ對妊娠早期滋養(yǎng)細胞浸潤起負性調(diào)節(jié)作用，PPARγ蛋白表達水平增高，可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ；絨毛組織；早期；自然流產(chǎn)

自然流產(chǎn)是妊娠最常見的疾病，育齡女性發(fā)病率為25%～50%［1］。在研究其病因時發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細胞的侵襲能力下降等一系列生物學(xué)行為的異?？赡軐?dǎo)致流產(chǎn)。因此，深入探討滋養(yǎng)細胞侵襲力下降的機制可能為自然流產(chǎn)的防治提供新的思路。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）是核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，具有調(diào)節(jié)目標基因表達的功能［2］，分為3個亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ，其中PPARγ生物學(xué)功能最復(fù)雜，國內(nèi)外對其研究也最多。Asami et al［3］在嚙齒動物中的實驗數(shù)據(jù)顯示，PPARγ在胎盤發(fā)育尤其是滋養(yǎng)細胞侵襲及分化中必不可少，表明PPARγ在妊娠中扮演著重要的角色。然而在人類滋養(yǎng)細胞分化及侵襲能力中的確切作用及影響機制尚未準確闡明。該實驗通過免疫組化PV兩步法和Western blot法檢測PPARγ蛋白在早孕和早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達變化，為研究PPARγ與自然流產(chǎn)的關(guān)系提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 選擇2012年6月～12月于安徽醫(yī)科大學(xué)婦幼保健臨床學(xué)院（安徽省合肥市婦幼保健院）婦科門診就診的40例早期自然流產(chǎn)患者作為實驗組，孕齡6.8～9.8周，年齡20～41（28.2 ±5.2）歲，B超顯示無胚芽或無胎心搏動。同期就診的正常早孕婦女，自愿要求終止妊娠者40例作為對照組，孕齡6.5～9.6周，年齡19～39（28.1± 5.2）歲，B超證實胚胎發(fā)育正常。兩組研究對象均無妊娠并發(fā)癥，無不良孕產(chǎn)史，術(shù)前1個月未服用激素類藥物，簽署終止妊娠同意書。經(jīng)負壓吸引流產(chǎn)術(shù)獲得兩組新鮮絨毛組織，無菌條件下剪取一部分組織放于液氮中快速凍存用于提取PPARγ蛋白，剩余另一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定后用于免疫組化。

1.1.2 主要試劑 PPARγ、β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；兩步法免疫組化試劑盒、DAB顯色劑、山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物制劑公司）；RIPA蛋白裂解液（北京普里奧基因公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法 詳細閱讀抗體說明書，嚴格控制操作步驟、實驗條件，檢測兩組絨毛組織中PPARγ蛋白表達情況，應(yīng)用免疫組化PV兩步法（抗體稀釋濃度1∶150），各組顯微照片的拍攝和沖洗均在相同條件下進行。

1.2.2Western blot法檢測 分別定量檢測對照組和實驗組絨毛組織中PPARγ蛋白表達水平，絨毛組織剪碎后加入RIPA裂解緩沖液1 ml（含10% PMSF），冰上充分裂解，將上清液中的可溶性蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（采用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯凝膠電泳方法）。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用抗PPARγ（1∶400）和β-actin（1∶500）行Western blot法檢測，實驗重復(fù)3次。Western blot法進行灰度掃描，用Image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)分析光密度值，有效值為特異性條帶平均光密度值與面積的乘積，反映蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實驗樣本比較觀察對照組和實驗組年齡、孕齡、孕次、產(chǎn)次等臨床特征，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 臨床特征（n＝40，±s）

表1 臨床特征（n＝40，±s）

臨床特征對照組實驗組t值P值年齡（歲）28.1±5.228.2±5.2－0.0210.98孕齡（年）8.0±0.68.0±0.8－0.1250.90孕次（次）2.5±1.22.6±1.00.4120.68產(chǎn)次（次）0.8±0.60.9±0.80.7950.43

2.2 PPARγ絨毛組織中免疫組化分析免疫組化顯示PPARγ蛋白在對照組與實驗組絨毛組織中細胞滋養(yǎng)層細胞及絨毛外滋養(yǎng)層細胞中均有表達，且實驗組PPARγ染色強度高于對照組。見圖1。

2.3 PPARγ蛋白在對照組和實驗組絨毛組織中的表達PPARγ蛋白在實驗組絨毛組織中的表達（1.780±0.120）明顯高于對照組（1.046±0.200），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明PPARγ蛋白可能參與了早期自然流產(chǎn)的病程。見圖2。

3 討論

正常妊娠時，滋養(yǎng)細胞侵入子宮蛻膜的機制雖與惡性腫瘤細胞的侵襲、浸潤相似，卻受到精確的調(diào)控，這一過程的失衡將會導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生。滋養(yǎng)細胞浸潤能力的下降，無法形成維持正常妊娠時所需的低阻力血管可導(dǎo)致自然流產(chǎn)。因此，深入探討滋養(yǎng)細胞侵襲力下降的機制可能為提高早期妊娠成功率提供新的思路。

研究［4］顯示PPARγ在妊娠期胎盤形成、發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，在人類妊娠相關(guān)性疾病（如子癇前期、妊娠期糖尿病、胎兒宮內(nèi)生長受限等）的胎盤中均有異常表達。在PPARγ缺失的小鼠中研究［5］顯示其終末滋養(yǎng)細胞分化及胎盤血管生成障礙，最終導(dǎo)致胚胎死亡，但通過嵌合體復(fù)位PPARγ基因可以拯救這一狀況。有研究［6］顯示PPARγ激活后刺激細胞滋養(yǎng)層細胞，促進其內(nèi)分泌功能，如PPARγ參與了人絨毛膜促性腺激素β亞單位的合成，對胎盤正常發(fā)育起重要作用。但目前對于其參與滋養(yǎng)細胞浸潤和分化的確切機制尚未闡明，尤其在早期自然流產(chǎn)中的表達變化方面，國內(nèi)對此研究甚少。本次試驗通過研究實驗組與對照組絨毛組織中PPARγ的表達差異推測PPARγ的表達異?？赡苁橇鳟a(chǎn)的病理生理因素之一。

研究［7］表明PPARγ只特定在滋養(yǎng)細胞中表達。孕早期，PPARγ蛋白主要在絨毛細胞滋養(yǎng)層中表達，并且早在妊娠第7周即可在絨毛外滋養(yǎng)層細胞中測到［8］，這與本次實驗結(jié)果一致。本次研究對象為孕早期婦女，顯示PPARγ蛋白在早孕及自然流產(chǎn)患者絨毛組織中細胞滋養(yǎng)層細胞及絨毛外滋養(yǎng)層細胞中均有表達。一方面，PPARγ被證實在正常的血管功能和滋養(yǎng)層血管系統(tǒng)分化中扮演了重要角色，是正常妊娠中必不可少的；另一方面，Rauwel et al［9］用人類巨細胞病毒作為激活物，激活PPARγ，發(fā)現(xiàn)阻礙了早期胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲。研究［10］表明PPARγ降低了胎盤血管形成必不可少的血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，而流產(chǎn)的發(fā)生可能存在胎盤滋養(yǎng)細胞浸潤能力不足，不能形成符合正常妊娠所需的低阻力血管。研究［11］顯示，孕6～8周到11～12周，PPARγ呈下降表達，而早孕期滋養(yǎng)細胞侵襲能力隨孕周增加而逐漸增強，說明PPARγ負性調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的侵襲、浸潤能力，對早孕期細胞滋養(yǎng)細胞的浸潤行為起抑制作用。研究［12］顯示PPARγ的過度激活損害了胚胎植入和胎盤化，從而影響胚胎發(fā)育。本次實驗中檢測到實驗組絨毛組織中PPARγ的高表達可能降低滋養(yǎng)細胞侵襲性，引起胚胎著床障礙，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。由此下一步可以擴大樣本量，研究是否能將PPARγ作為早期診斷流產(chǎn)的標志物質(zhì)，為防治早期流產(chǎn)提供新思路，并作為判斷療效的一項參考指標。

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PPARγ expressed in villi in the organization and the relationship with spontaneous abortion

Chen Guo1，2，Cheng Linghui1，Liu Bo2，et al
（1Dept of Gynaecology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Gynaecology，Anhui Women and Child Health Care Hospital，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the protein expression of PPARγ in villi of first trimester spontaneous abortion.MethodsTo detect the expression of PPARγ in villi of normal first trimester pregnant women（control group，n＝40）and first trimester spontaneous abortion（experimental group，n＝40）by immunohistochemistry and Western blot.ResultsPPARγ localisation was researched by immunohistochemiscalMethods；and in control and experimental group，the protein was observed in both villous and extravillous trophoblast nuclei.Western blot analysis showed that in villi of experimental group，expression of PPARγ was significantly increased than that of control group（P＜0.01）.ConclusionPPARγ may play an important role in the modulation of thophoblast invasion，a significantly enhanced expression of PPARγ is identified in villous and extravillous trophoblast of miscarriage patients may be one factor linked to spontaneous abortion.

PPARγ；villi；first trimester；spontaneous abortion

R 714.21

1000－1492（2015）02－0214－03

2014－09－28接收

安徽省年度科研計劃（編號：10021303020）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，合肥 2300222安徽省婦幼保健院（安徽醫(yī)科大學(xué)婦幼保健臨床學(xué)院），合肥 230032

陳 果，女，碩士研究生；程玲慧，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenglinghui71＠163.com