穩(wěn)定敲低SIGIRR的人腎小管上皮細胞的構建及其初步功能的研究

蔣克國，王德光，周海勝，查曉軍，張桂霞，金福泉，季 爽，潘海峰，葉冬青，郝 麗

◇基礎醫(yī)學研究◇

穩(wěn)定敲低SIGIRR的人腎小管上皮細胞的構建及其初步功能的研究

蔣克國1，王德光1，周海勝2，查曉軍2，張桂霞1，金福泉3，季 爽4，潘海峰5，葉冬青5，郝 麗1

目的建立穩(wěn)定敲低單免疫球蛋白白介素1相關受體（SIGIRR）基因的人腎小管上皮細胞株（HKC），并初步研究其功能。方法 針對SIGIRR基因的有效靶點設計shRNA序列，與GV248-GFP-Puro慢病毒載體連接產(chǎn)生重組體（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR）。將測序驗證正確的重組體與包裝質粒（pMDL、pRev、pVSVG）共轉染293T細胞進行病毒包裝，收集病毒并感染HKC細胞。實時熒光定量PCR（qRTPCR）和Western blot法分析檢測HKC細胞中SIGIRR干涉效率。應用白細胞介素-1β（IL-1β）刺激成功敲低SIGIRR的HKC細胞及對照細胞，Western blot法檢測其下游核轉錄因子NF-κB（p65）的磷酸化水平，qRT-PCR分析單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、正常T細胞表達和分泌的活化調節(jié)蛋白（RANTES）mRNA水平。結果成功構建重組慢病毒載體GV248-GFP-Puro-shSIGIRR。qRT-PCR和Western blot法均證實在HKC細胞中成功敲低SIGIRR的表達。此外，IL-1β刺激后，與對照細胞相比，敲低SIGIRR的HKC細胞（HKC／shSIGIRR）的p65磷酸化水平上調，MCP-1和RANTES mRNA表達水平升高。結論 HKC的炎癥反應中，SIGIRR蛋白對Toll樣受體／白介素1受體（TLR／IL-1R）通路起“剎車”作用。該研究為狼瘡性腎炎的治療提供了新的潛在的靶點。

狼瘡性腎炎；人腎小管上皮細胞；SIGIRR；慢病毒載體；NF-κB；趨化因子

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）最常見的并發(fā)癥之一，而腎臟受累的嚴重程度對SLE患者死亡率及預期壽命有顯著影響［1－2］。但LN發(fā)病機制尚未完全明確。研究［3－7］提示LN的發(fā)生和發(fā)展與腎小管上皮細胞內Toll樣受體／白介素1受體（Toll-like receptor／IL-1 receptor，TLR／IL-1R）信號通路的活化有關，核轉錄因子NF-κB激活，產(chǎn)生趨化因子［如單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、正常T細胞表達和分泌的活化調節(jié)蛋白（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）］調節(jié)炎癥細胞向腎組織浸潤和活化。有研究［8－9］提示單免疫球蛋白白介素1相關受體（single immunoglobin IL-1-related receptor，SIGIRR）對TLR／IL-1R信號通路起負調控作用，因此有望成為LN治療新的潛在的靶點。該研究以人腎小管上皮細胞（human renal tubule epithelial cells，HKC）作為模型，構建針對SIGIRR基因的小發(fā)夾狀RNA（small hairpin RNA，shRNA）的慢病毒表達載體，包裝成病毒感染HKC細胞，建立SIGIRR穩(wěn)定下調的HKC細胞系（HKC／shSIGIRR），并探討在TLR／IL-1R信號通路激動劑白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）誘導下，NF-κB（p65）的磷酸化水平和其下游靶基因MCP-1和RANTES趨化因子mRNA水平的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株、菌株與載體 HKC細胞購自北京協(xié)和細胞資源中心；293T細胞由實驗室保存；Top10感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司；GV248-GFP-Puro購自上海吉凱基因化學技術有限公司；pMDL、pRev和pVSVG質粒由實驗室保存。

1.1.2抗體及主要試劑 兔抗SIGIRR抗體購自美國Ori Gene公司；兔抗p-p65抗體和兔抗p65抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司；IL-1β購自美國Pepro Tech公司；Polybrene購自美國Millipore公司；嘌呤霉素購自美國Santa Cruz Biotechnologyinc公司；NuPAGE 10%Bis-Tris GEL 1.5 mm×10 Well、LipofectaminTM2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Life Technologies公司；DMEM／F12、DMEM／高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；Age I和EcoR I購自美國New England Biolabs公司；質粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas公司；T4DNA連接酶和SYBR?Premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HKC細胞采用含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。293T細胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清DMEM／高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。37℃、5.0%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞在對數(shù)生長期，狀態(tài)良好并且密度達到約80%時，使用0.25%的胰蛋白酶消化后，進行傳代、凍存或其他實驗。

1.2.2慢病毒干涉載體構建及包裝 SIGIRR特異性干涉序列選自Public TRC Portal網(wǎng)站（http：／／www.broadinstitute.org／rnai／public／gene／search），從中選取3個靶序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成3對單鏈DNA序列。見表1。退火處理后連接至GV248-GFP-Puro慢病毒載體。見圖1A。將重組體命名為GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-1＃、GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-2＃、GV248-GFP-PuroshSIGIRR-3＃。轉化Top10大腸桿菌、挑選陽性克隆、提取質粒，由上海生工生物工程股份有限公司測序驗證。

取成功構建的重組慢病毒載體及GV248-GFPPuro-shScramble（實驗室先前構建，序列見表1）分別和包裝質粒（pMDL、pRev、pVSVG）共轉染293T細胞。轉染前2 h將細胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)基。轉染后混合培養(yǎng)8 h后更換含10%血清的DMEM／高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。因載體帶有綠色熒光蛋白報告基因，24 h后可觀察轉染效率。轉染后48、72 h，收集含有病毒的上清液。將收集的上清液1 500 r／min離心5 min，0.45 μm的濾膜過濾，－80℃儲存、備用。

1.2.3孔稀釋法測定病毒滴度 測定前1 d將生長狀態(tài)良好的293T細胞消化稀釋至1.0×105／ml，加入96孔板，100 μl／孔，每個病毒10個孔。感染當日將含有病毒的上清液，在EP管中做連續(xù)10個 10倍梯度稀釋。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒液100 μl／孔加到細胞孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μl新鮮培養(yǎng)液。72 h后觀察熒光并計數(shù)最大稀釋倍數(shù)孔中的帶有熒光的細胞個數(shù)。病毒滴度（TU／ml）＝熒光細胞個數(shù)×稀釋倍數(shù)／病毒體積。

表1 3對單鏈及shScramble DNA序列

1.2.4慢病毒感染HKC細胞及穩(wěn)定篩選 接種狀態(tài)良好的HKC細胞至6孔板，密度約40%，待細胞貼壁后，按照病毒定量結果加入病毒上清液，同時加入Polybrene至終濃度為6 μg／ml。6 h后更換完全培養(yǎng)基。次日重復感染1次，72 h后熒光顯微鏡下觀察感染情況，加入嘌呤霉素2 μg／ml繼續(xù)篩選培養(yǎng)2周，直至單克隆細胞群形成。

1.2.5細胞總RNA提取、逆轉錄和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測 使用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和光密度（optical density，OD）OD260／OD280比值，并且采用1%普通瓊脂糖凝膠電泳對RNA質量進行快速分析。取1 000 ng總RNA，使用RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit對RNA進行反轉錄成總cDNA，并稀釋20倍作為qRT-PCR檢測模板。利用SYBR?Premix Ex TaqTM進行qRTPCR檢測，引物序列見表2。反應體系為20 μl，每組樣品設置3個重復；擴增程序：95℃預變性2 min、94℃變性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.2.6細胞總蛋白提取和Western blot法檢測 收集細胞總蛋白前，PBS清洗2次，加入Western blot細胞裂解液在冰上裂解30 min，100℃水浴10 min，制備細胞總蛋白樣品。采用NuPAGE 10%Bis-Tris GEL 1.5 mm×10 Well分離膠電泳分離細胞總蛋白，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜后，將其置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫搖床上封閉45 min。根據(jù)目標蛋白不同分子量大小切取PVDF膜條帶置于按要求稀釋的一抗中，4℃搖床上孵育過夜。次日將TBST洗脫后的PVDF膜條帶再置于按要求稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫孵育5 h后，TBST洗脫，暗室中超敏X線片曝光顯示結果，灰度掃描分析軟件計算各區(qū)帶密度值。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.7IL-1β誘導實驗 將HKC、HKC／shScramble（GV248-GFP-Puro-shScramble感染的HKC細胞）、HKC／shSIGIRR（已證明穩(wěn)定敲低SIGIRR的HKC細胞）細胞接種至12孔板培養(yǎng)，分為2組，一組在對數(shù)生長期加入終濃度為10 ng／ml的IL-1β，另一組正常培養(yǎng)，24 h后分別收集細胞總RNA、總蛋白用于實驗研究。該實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 成功構建GV248-GFP-Puro-shSIGIRR慢病毒載體經(jīng)雙酶切的GV248-GFP-Puro與退火后的shRNA連接后產(chǎn)生3個重組慢病毒載體。轉化Top10大腸桿菌，長出克隆后提取質粒，由上海生工生物工程股份有限公司測序證實插入序列正確，說明成功構建載體。見圖1。

2.2 慢病毒包裝和滴度測定并成功高效感染HKC細胞構建的重組慢病毒載體和GV248-GFP-PuroshScramble分別和包裝質粒共轉染293T細胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察均可見大量熒光，提示轉染成功。見圖2。采用孔稀釋法測定慢病毒滴度為（4× 107～6×107）TU／ml。將收集的慢病毒連續(xù)2次感染HKC細胞后，72 h后熒光顯微鏡觀察顯示80%以上HKC細胞表達熒光蛋白，提示成功感染。見圖3。

2.3 HKC細胞中SIGIRR干涉效果檢測提取經(jīng)嘌呤霉素篩選2周后的HKC／shScramble、HKC／shSIGIRR-1＃（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-1＃感染的HKC細胞）、HKC／shSIGIRR-2＃（GV248-GFP-PuroshSIGIRR-2＃感染的HKC細胞）、HKC／shSIGIRR-3＃（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-3＃感染的HKC細胞）與HKC的總RNA和總蛋白。qRT-PCR和Western blot法分析結果提示HKC／shSIGIRR-2＃與HKC／shSIGIRR-3＃中的SIGIRR表達均受到干涉，后者更加明顯。在mRNA和蛋白水平上，與HKC／shScramble相比HKC／shSIGIRR-3＃敲低SIGIRR表達＞70%（t＝6.289，P＜0.01；t＝5.562，P＜0.01）。見圖4。因此成功獲得穩(wěn)定敲低SIGIRR基因的HKC細胞株—HKC／shSIGIRR-3＃命名為HKC／shSIGIRR，用于下一步的細胞實驗分析。

2.4 IL-1β誘導HKC／shSIGIRR后核轉錄因子NF-κB（p65）的磷酸化與MCP-1和RANTES趨化因子mRNA的變化Western blot法分析經(jīng)IL-1β（10 ng／ml，24 h）誘導和未誘導的HKC、HKC／shScramble和HKC／shSIGIRR的各組細胞p65磷酸化水平改變情況。結果顯示敲低SIGIRR基因，其下游基因p65的磷酸化水平較HKC／shScramble明顯升高（t＝2.941，P＜0.05）。提示在HKC細胞中，敲低SIGIRR解除了SIGIRR對TLR／IL-1R信號通路的抑制，導致NF-κB過度激活。見圖5。NF-κB信號的激活會通過增強下游趨化因子的表達從而參與LN的發(fā)生和發(fā)展。因此，需進一步分析敲低SIGIRR是否會影響NF-κB下游靶基因（MCP-1、RANTES）的表達。收集經(jīng)IL-1β（10 ng／ml，24 h）誘導和未誘導的HKC、HKC／shScramble和HKC／shSIGIRR的總RNA，經(jīng)qRT-PCR分析顯示：與HKC／shScramble相比，敲低SIGIRR的HKC細胞中MCP-1和RANTES的mRNA表達水平均明顯升高（t＝3.189，P＜0.05；t＝2.838，P＜0.05），見圖6。

3 討論

TLR／IL-1R信號通路在炎癥反應和天然防御免疫中起著重要作用，當TLR／IL-1R與IL-1及某些TLR激動劑（如脂多糖、IL-1β等）配體結合后，TLR／IL-1R信號即被觸發(fā)，其通過MyD88依賴通路或MyD88非依賴通路激活NF-κB，NF-κB可參與MCP-1和RANTES等多種趨化因子的表達，募集炎癥細胞聚集發(fā)生炎癥反應，但TLR／IL-1R信號通路過度激活可造成機體免疫損傷［4－8］。為避免該現(xiàn)象的發(fā)生，體內尚存有相應負調控成分以保證機體免疫反應的適度和穩(wěn)定，廣泛表達在腎小管上皮細胞、消化道和肺等器官組織的SIGIRR便是其中之一。人SIGIRR定位于11 p15.5，雖然SIGIRR屬于TLR／IL-1R超家族中的IL-1R亞族，然而在功能上，不能介導TLR／IL-1R的炎癥信號轉導，相反還可能抑制TLR／IL-1R信號的下傳，起到“剎車”作用，但其作用機制目前尚不明確［8］。

Lech et al［10］發(fā)現(xiàn)，敲除SIGIRR基因的B6lpr／lpr鼠表現(xiàn)為狼瘡自身抗原誘導的樹突細胞激活增加及B細胞增殖、多種自身抗體產(chǎn)生增多、腎小球單核細胞浸潤增多及組織損傷加重。在碳氫化合物誘導的狼瘡模型中，SIGIRR敲除小鼠血清自身抗體、尿蛋白量及LN活動指數(shù)均明顯升高［11］。另一方面，學者［12－13］在腫瘤細胞系A549、H292等細胞中發(fā)現(xiàn)過度表達SIGIRR，也能夠抑制NF-κB的活化，減少IL-1β、TNF-α等細胞因子的分泌，這說明SIGIRR可以阻斷腫瘤細胞中TLR／IL-1R-NF-κB信號通路的激活從而緩解癌癥中過度的炎癥反應。提示SIGIRR在炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色，但是在腎小管上皮細胞的炎癥反應中，SIGIRR蛋白對TLR／IL-1R通路是否起到抑制作用，國內尚未見報道。

特異性強、效率高的RNA干擾技術，提供了一個逆向研究SIGIRR基因在自身免疫性疾病分子病因中作用的方法，而設計和構建敲低靶基因的shRNA表達慢病毒載體是實驗的核心技術［14－15］。該研究成功構建的重組慢病毒干涉載體，經(jīng)過實驗證明能夠有效干涉HKC細胞中SIGIRR的表達，經(jīng)過嘌呤霉素篩選后構建成穩(wěn)定敲低SIGIRR的HKC細胞。本研究顯示對SIGIRR敲低后，在IL-1β誘導下NF-κB（p65）的磷酸化水平和趨化因子MCP-1和RANTES mRNA表達增加，闡述了SIGIRR能夠在HKC細胞的炎癥反應中對TLR／IL-1R通路起到“剎車”作用。該研究為進一步探索SIGIRR在TLR／IL-1R通路或者其他信號傳導通路中的功能研究奠定基礎。為SIGIRR作為生物制劑進行干預治療LN帶來了一線曙光。

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Construction of SIGIRR stable knockdown human renal tubular epithelial cells and exploration of its function

Jiang Keguo1，Wang Deguang1，Zhou Haisheng2，et al
（1Dept of Nephrology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medicine Basical，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo establish single immunoglobin IL-1-related receptor（SIGIRR）stable knockdown human renal tubular epithelial cells（HKC）and explore its function.MethodsDesigned the effective targeted shRNA sequences for the SIGIRR gene，and then connected with the GV248-GFP-Puro to produce recombinant lentiviral vector（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR）.The corrected recombinants，identified by sequenced，were transfected into 293T cells with packaging plasmids（pMDL，pRev，pVSVG）for virus packaging.HKC cells were then infected by packaged viruses.Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）and Western blot were used to detect the interference efficiency of SIGIRR in HKC cells.SIGIRR stable knockdown HKC cells（HKC／shSIGIRR）and the control cells were induced by IL-1β，then the downstream nuclear transcription factor，the phosphorylated NF-κB（p65）were detected by Western blot.The mRNA expression levels of chemokine monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）and regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor（RANTES）were analyzed by qRT-PCR.ResultsTheResultsshowed that the recombinant lentiviral vector GV248-GFP-Puro-shSIGIRR was successfully constructed.qRT-PCR and Western blot confirmed that SIGIRR was knockdown in HKC cells.Moreover，theResultsalso showed that compared with the control cells，the phosphorylated NF-κB（p65）and the mRNA levels of MCP-1 and RANTES were significantly increased in HKC／shSIGIRR cells by being stimulated with IL-1β.ConclusionTheResultssuggest that SIGIRR acts as a“brake”of inflammatory reaction in Toll-like receptor／IL-1 receptor（TLR／IL-1R）pathway in HKC cells.The study may provide a potential new target for the treatment of Lupus nephritis.

lupus nephritis；human renal tubular epithelial cells；SIGRR；lentiviral vector；NF-κB；chemokine

R 593.24＋2；R 392.11

1000－1492（2015）02－0129－07

2014－10－23接收

安徽省博士后科學基金（編號：9101019202）；中國博士后科學基金（編號：2012M511399）；國家自然科學基金（編號：81101524、81372475、81172591）

1安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腎臟內科，合肥 230601安徽醫(yī)科大學2基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室、3藥學院、4第一臨床學院、5公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計系，合肥 230032

蔣克國，男，主治醫(yī)師，碩士研究生；王德光，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangdeguang＠ahmu.edu.cn；周海勝，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：haishengs＠ahmu.edu.cn；查曉軍，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhaxiaojunpumc＠gmail.com