枯草芽孢桿菌產(chǎn)過氧化氫酶的優(yōu)化與工業(yè)化

曹汶龍， 郭婭瓊， 康 振， 堵國成*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

枯草芽孢桿菌產(chǎn)過氧化氫酶的優(yōu)化與工業(yè)化

曹汶龍1，2， 郭婭瓊1，2， 康 振1，2， 堵國成1，2*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為了實(shí)現(xiàn)過氧化氫酶的工業(yè)化生產(chǎn)，作者對實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)造成功的B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA）進(jìn)行了3 L發(fā)酵罐的發(fā)酵驗(yàn)證，并且通過數(shù)據(jù)分析優(yōu)化了碳氮源濃度，使得過氧化氫酶酶活達(dá)到35 398 U/mL，比優(yōu)化前提高53.41%。在此基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行了24 L發(fā)酵罐和500 L發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)，最高酶活分別達(dá)到28 940、23 190 U/mL。結(jié)果表明，該過氧化氫酶在產(chǎn)酶水平上已經(jīng)達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)需求，為更大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌；過氧化氫酶；優(yōu)化；放大實(shí)驗(yàn)

過氧化氫酶（Hydrogen peroxide oxidoreductase，編號(hào)EC 1.11.1.6.）又稱觸媒（Catalase），簡稱CAT，是廣泛存在于動(dòng)植物以及微生物體內(nèi)的一類末端氧化酶。生物在演化過程中逐步建立起的防御系統(tǒng)中，CAT就是關(guān)鍵酶之一[1]。CAT的生物學(xué)功能是促使過氧化氫（H2O2）分解為分子氧和水，從而防止機(jī)體的過氧化，使細(xì)胞免于H2O2的毒害[2]。

過氧化氫酶是一種催化效率非常高的生化酶，在臨床、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)具有廣泛的用途。在臨床分析中，CAT對研究腫瘤發(fā)病機(jī)理、自由基代謝失衡和抗衰老以及鑒別診斷某些疾病具有重要意義[3]。在醫(yī)藥行業(yè)，由于H2O2具有殺菌、清潔、漂白及消毒的功效，常被用于器械消毒，如在隱形眼鏡消毒過程中添加CAT可分解消毒液中殘留的H2O2；在紡織工業(yè)中，傳統(tǒng)的工藝消耗大、污染大[4-5]，利用CAT能快速除去H2O2，可以省去清洗步驟或只需一次冷水洗滌即可。這樣既節(jié)約能源、保護(hù)環(huán)境，又保證了紡織物的質(zhì)量。

盡管過氧化氫酶具有高效、環(huán)保、處理效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，但是其高昂的價(jià)格、在工業(yè)應(yīng)用中容易失活等問題依舊阻礙著其在紡織工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用。為了更好地在工業(yè)中應(yīng)用，一方面需要提高發(fā)酵水平以降低成本，另一方面考慮到紡織加工處理的工藝條件，需要開發(fā)出更加適應(yīng)高溫和堿性條件的過氧化氫酶用于過氧化氫漂白的后處理[6]。

為了克服上述的困難，在之前的研究中，江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工工程實(shí)驗(yàn)室篩選出一株耐熱、耐堿CAT的高產(chǎn)菌株B.subtilis WSHDZ-01[7]，利用基因重組技術(shù)成功克隆了B.subtilis WSHDZ-01菌株的 CAT基因序列，并將其在 B.subtilis WSHDZ-01中過量表達(dá)，最終獲得了一株高產(chǎn)CAT的枯草芽孢桿菌工程菌。

在本研究中，為了提高CAT的產(chǎn)量，并且將其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，我們在實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，考察影響CAT產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，對發(fā)酵過程以及培養(yǎng)基碳氮源濃度進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，逐級(jí)進(jìn)行放大生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，利用實(shí)驗(yàn)室3 L發(fā)酵罐 （型號(hào)BioFlo/CelliGen 115，美國NBS公司生產(chǎn)）進(jìn)行發(fā)酵，摸索最優(yōu)化條件，并在宜興協(xié)聯(lián)化學(xué)有限公司進(jìn)行24 L和500 L發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)，使CAT產(chǎn)量最終達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒枯草芽孢桿菌WSHDZ-01：產(chǎn)過氧化氫酶菌株，由作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選得到，作為代謝工程改造菌及發(fā)酵宿主。穿梭質(zhì)粒pstop1622[8]：由德國布倫瑞克大學(xué)構(gòu)建并饋贈(zèng)，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及過氧化氫酶基因的表達(dá)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基：6°P麥芽汁，瓊脂1.5～2.0 g/dL，pH 7.5。

2）種子培養(yǎng)基：6°P麥芽汁，pH 7.5。

3）基本發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 10，NaNO35，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO49.52，KH2PO40.6，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.002 5；pH自然。

根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素至終質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA）經(jīng)搖瓶種子培養(yǎng)基 （25 mL/250 mL）于37℃、200 r/min活化，12 h后以5%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到搖瓶基本發(fā)酵培養(yǎng)基中 （25 mL/250 mL），37℃、200 r/min培養(yǎng)56 h（OD600nm=1.0時(shí)加入0.5 g/dL木糖進(jìn)行誘導(dǎo)），測定CAT活性。

3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：重組菌按照上述方法培養(yǎng)，菌液轉(zhuǎn)入（5%接種體積分?jǐn)?shù)）發(fā)酵罐（3 L罐裝液1.8 L）。通氣量為1.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，37℃培養(yǎng)（OD600nm=1.0時(shí)加入0.5 g/dL木糖進(jìn)行誘導(dǎo)），pH不作控制。

24 L發(fā)酵罐（宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司自行設(shè)計(jì)）培養(yǎng)：重組菌按照上述方法培養(yǎng)，菌液轉(zhuǎn)入（1%接種體積分?jǐn)?shù)）24 L發(fā)酵罐中發(fā)酵 （裝液量60%）?？諝馔ㄈ肓繛?.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，37℃培養(yǎng) （溶氧反彈時(shí)加入0.5 g/dL木糖進(jìn)行誘導(dǎo)），pH不作控制。

500 L發(fā)酵罐 （宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司自行設(shè)計(jì)）培養(yǎng)：重組菌按照上述方法培養(yǎng)，菌液轉(zhuǎn)入（1%接種體積分?jǐn)?shù)）24 L發(fā)酵罐中（60%裝液量），37℃發(fā)酵培養(yǎng)12 h，空氣通入量為1.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，12 h后將全部種子液轉(zhuǎn)入500 L發(fā)酵罐中，空氣通入量為1.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，37℃培養(yǎng) （溶氧反彈時(shí)加入0.5 g/dL木糖進(jìn)行誘導(dǎo)），pH不作控制。

1.2.2 CAT檢測方法取一定量發(fā)酵液，4℃下12 000 r/min離心10 min，獲得的上清液作為胞外CAT的測定用樣品。

37℃條件下采用分光光度法測定CAT活性，反應(yīng)體系為3 mL。將0.1 mL待測酶液樣品快速加入到 2.9 mL含 10 mmol/L H2O2的 50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液（pH 7.0）中，用UV-2450型紫外-可見光分光光度計(jì)于240 nm處測定H2O2的分解速率。酶活定義為：37℃下每分鐘分解1 μmol H2O2所需酶量為一個(gè)酶活單位。

1.2.3 理化參數(shù)檢測方法適當(dāng)加水稀釋發(fā)酵液，通過比濁法[9]測定其吸光度值OD600nm，從而確定菌體濃度。

還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法[10]。

硝酸鹽含量測定采用紫外分光光度法[11]。首先將樣品在25 mL具塞比色皿中適當(dāng)稀釋，然后加入0.5 mL濃度為0.1 mol/L鹽酸，分別測定275 nm和220 nm處的吸光度值。A=A220nm-A275nm，求得吸光度的校準(zhǔn)值后，從校準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的硝酸鹽濃度，響應(yīng)數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即得所測樣品的硝酸鹽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）3 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證

為了實(shí)現(xiàn)直接將工程菌放大至工業(yè)化生產(chǎn)，研究 采 用 B.subtilis WSHDZ-01 （pSTOP1622-katA1672）作為出發(fā)菌株，進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)條件其產(chǎn)酶情況進(jìn)行驗(yàn)證。采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基組分，裝液量60%，通氣量1.0 vvm，轉(zhuǎn)速400 r/min，37℃下發(fā)酵56 h（溶氧反彈時(shí)加入0.5 g/dL木糖進(jìn)行誘導(dǎo)），間隔4 h取樣測定CAT活性。胞外CAT最高活性出現(xiàn)在48 h，可達(dá)23 074 U/mL。通過分析發(fā)酵過程中菌體濃度、CAT活力、殘?zhí)堑葏?shù)之間的關(guān)系見圖1。發(fā)酵進(jìn)行12 h后培養(yǎng)基中葡萄糖基本耗完，菌濃無法上升，從而限制了CAT活性的進(jìn)一步提高。提高菌體濃度可能會(huì)對提高酶活有一定的影響，因此設(shè)想提高初始碳氮源質(zhì)量濃度可提高CAT的產(chǎn)量。

2.2 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）3 L發(fā)酵罐碳源質(zhì)量濃度控制

3 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證得到的數(shù)據(jù)變化見圖2。菌體在生長過程中快速消耗了大量的葡萄糖，發(fā)酵進(jìn)行12 h后，培養(yǎng)基中葡萄糖基本耗完，葡萄糖質(zhì)量濃度過低限制了菌體的生長以及氮源的利用。

因此，可以通過增加初始培養(yǎng)基中碳氮源的質(zhì)量濃度，讓菌體在初始階段大量增殖，而菌體在后期葡萄糖貧乏的條件下更好地利用氮源產(chǎn)生CAT。因此我們采取的策略是維持其他組分及含量不變，使培養(yǎng)基中碳氮源加倍，3 L發(fā)酵罐相同發(fā)酵條件下培養(yǎng)56 h，測定CAT的產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中碳氮源加倍后胞外CAT的活性大幅上升，48 h時(shí)達(dá)35，398 U/mL，與單倍碳氮源發(fā)酵相比提高53.41%。

圖1 B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）3 L罐發(fā)酵參數(shù)分析Fig.1 Analysis of B.subtilis WSHDZ-01 （pSTOP1622-katA1672）in a 3 L stirred tank reactor

圖2 3 L罐碳氮源加倍發(fā)酵參數(shù)分析Fig.2 Extracellular CAT activity of B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）in a 3 L stirred tank reactor with doubled carbon-nitrogen source

2.3 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）24 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證

在實(shí)驗(yàn)室水平下，B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）在3 L發(fā)酵罐的酶活高達(dá)35 398 U/mL，已經(jīng)具備了工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。因此，我們在宜興協(xié)聯(lián)化學(xué)有限公司進(jìn)行了逐級(jí)放大實(shí)驗(yàn)。首先在24 L發(fā)酵罐中對B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果見圖3。在雙倍碳氮源條件下，24 L發(fā)酵罐中酶活達(dá)到28 940 U/mL，而且通過OD600的數(shù)值可以發(fā)現(xiàn)，在24 L發(fā)酵罐中菌體生長狀況不是很好，最高菌濃僅為3 L發(fā)酵罐的62.7%，原因可能是在24 L發(fā)酵罐中所使用的化學(xué)試劑均為工業(yè)級(jí)，相比實(shí)驗(yàn)室分析純的試劑在純度上有一定的差距，才導(dǎo)致菌體生長狀況不是很好。雖然菌濃不高，但是菌體產(chǎn)酶效率很高，最高酶活為3 L發(fā)酵罐的81.7%。已基本滿足工業(yè)化的生產(chǎn)需求。

圖3 B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）24 L罐發(fā)酵參數(shù)分析Fig.3 Analysis of B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）in 24 L stirred tank reactor

2.4 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）500 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證

在24 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)取得成功后，我們繼續(xù)嘗試在500 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4?？梢钥闯觯?00 L發(fā)酵罐中，菌體的延遲期增長，對數(shù)生長期縮短，最后導(dǎo)致菌體生長到最高菌濃所需時(shí)間有了一定的延后，從而致使酶活最高點(diǎn)出現(xiàn)在52 h處，達(dá)到23 190 U/mL，是24 L發(fā)酵罐最高酶活的80.1%。從上述規(guī)律可以看出，隨著罐體體積的增加，酶活產(chǎn)量有一定的下降趨勢，發(fā)酵周期有所延長，但酶活產(chǎn)量水平已經(jīng)達(dá)到了工業(yè)化的生產(chǎn)要求。

3 結(jié)語

近年來，隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應(yīng)用，市場對過氧化氫酶的需求也呈大幅增長趨勢。尤其是在棉織物的前處理工藝中，過氧化氫酶起著重要的作用，紡織熱漂步驟中使用過氧化氫酶是實(shí)現(xiàn)紡織工業(yè)節(jié)能減排和可持續(xù)發(fā)展的有效方法。目前商品化過氧化氫酶的價(jià)格較高，溫度和pH耐受范圍較低，這些都制約著過氧化氫酶在紡織工業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。

作者驗(yàn)證了B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）在3 L發(fā)酵罐中有著優(yōu)良的產(chǎn)酶能力，并且通過優(yōu)化碳氮源濃度使得酶活有了大幅度的提升。作者還在24 L發(fā)酵罐和500 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株在工業(yè)化條件下產(chǎn)酶性能依然優(yōu)良，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。雖然本研究在產(chǎn)量方面達(dá)到了工業(yè)化的生產(chǎn)要求，但是仍有一些不足，比如從3 L發(fā)酵罐擴(kuò)大到500 L發(fā)酵罐，酶活呈下降的趨勢，其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝仍有待進(jìn)一步的研究優(yōu)化，除此之外，今后的研究還可以圍繞提高過氧化氫酶的耐熱性以及耐堿性展開，以提高其在工業(yè)中的應(yīng)用性能。

[1]Sendur OF，Turan Y，Tastaban E，et al.Antioxidant status in patients with osteoporosis：a controlled study[J].Joint Bone Spine，2009，76（5）：514-518.

[2]Cabiscol E，Tamarit J，Ros J.Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species[J].International Microbiology，2010，3（1）：3-8.

[3]Usui S，Komeima K，Lee S Y，et al.Increased expression of catalase and superoxide dismutase 2 reduces cone cell death in retinitis pigmentosa[J].Molecular Therapy，2009，17（5）：778-786.

[4]Gudelj M，F(xiàn)ruhwirth G，Paar A，et al.A catalase-peroxidase from a newly isolated thermoalkaliphilic Bacillus sp.with potential for the treatment of textile bleaching effluents[J].Extremophiles，2001，5（6）：423-429.

[5]冷曬祥，錢國坻，華兆哲，等.過氧化氫酶的棉針織物漂染工藝研究[J].印染，2006，32（19）：1-3.

LENG Shaixiang，QIAN Guodi，GUA Zhaozhe，et al.Catalase for H2O2removal after cotton knits bleaching[J].Dyeing& Finishing，2006，32（19）：1-3.（in Chinese）

[6]張東旭，堵國成，陳堅(jiān).微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（11）：1473-1481.

ZHANG Dongxu，DU Guocheng，CHEN Jian.Fermentation production of microbial catalase and its application in textile industry [J].Chinese Journal of Biotechnology，2010，26（11）：1473-1481.（in Chinese）

[7]姚丹丹，劉立明，李江華，等.活性氧脅迫促進(jìn)枯草芽孢桿菌WSHDZ-01過量合成過氧化氫酶[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（5）：786-792.

YAO Dandan，LIU Liming，LI Jianghua，et al.Overproduction of catalove by oxidative stress on Bacillus subtilis WSHDZ-01[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2009，25（5）：786-792.（in Chinese）

[8]Biedendieck R，Yang Y，Deckwer WD，et al.Plasmid system for the intracellular production and purification of affinity-tagged proteins in Bacillus megaterium[J].Biotechnology and Bioengineering，2007，96（3）：525-537.

[9]Dwivedi P，Wu P，Klopsch S J，et al.Metabolic profiling by ion mobility mass spectrometry（IMMS）[J].Metabolomics，2008，4（1）：63-80.

[10]Zhu S，Wu Y，Yu Z，et al.Production of ethanol from microwave-assisted alkali pretreated wheat straw[J].Process Biochemistry，2006，41（4）：869-873.

[11]Rai U，Sinha S，Tripathi R，et al.Wastewater treatability potential of some aquatic macrophytes：removal of heavy metals[J]. Ecological Engineering，1995，5（1）：5-12.

Optimization and Industrial Production of Catalase in Bacillus subtilis

CAO Wenlong1，2， GUO Yaqiong1，2， KANG Zhen1，2， DU Guocheng1，2*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Microorganism catalase，which is an important industrial enzyme，plays an important role in textile industry.To realize the industrial production of catalase，the fermentation on B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA），which was constructed before，was conducted in 3 L fermentor. Furthermore，the enzyme activity reached 35 398 U/mL after optimization of carbon and nitrogen concentration，which was increased by 53.41%compared with that before optimization.Based on this result，the fermentations in 24 L and 500 L fermentor were carried out，respectively and the maximum enzyme activity was 28 940 U/mL and 23 190 U/mL respectively.The result showed the yield of catalase has met the requirement of industrial production，which lay a solid foundation for larger-scale industrial production.

Bacillus subtilis，catalase，fermentation，optimization，larger-scale production

S 665.2

A

1673—1689（2015）05—0482—05

2014-02-28

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA022202）；國家博士后基金面上項(xiàng)目（2013 M540414）；江蘇省博士后基金項(xiàng)目（1301010B）。

*通信作者：堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化與控制、酶工程與技術(shù)、代謝工程技術(shù)方面的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn