毛酸漿多酚氧化酶的酶學特性研究

高新新， 位 珍， 常 晨， 劉俊坤， 王 萍

（東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

毛酸漿多酚氧化酶的酶學特性研究

高新新， 位 珍， 常 晨， 劉俊坤， 王 萍*

（東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以毛酸漿中多酚氧化酶（PPO）為研究對象，采用分光光度法在420 nm處對其酶學特性進行研究。結(jié)果表明，毛酸漿PPO的底物鄰苯二酚的最適質(zhì)量分數(shù)為0.04%；最適pH為7.0；最適溫度為35℃；100℃處理2 min，可使酶完全失活；PPO催化的酶促褐變反應動力學符合米氏方程，動力學參數(shù)為Km=0.025 mol/L，Vmax=125 U/min；抗壞血酸、檸檬酸、L-半胱氨酸和亞硫酸鈉對PPO酶活性的抑制作用均隨濃度的增大而加強，抑制能力由強到弱依次為：抗壞血酸＞檸檬酸＞L-半胱氨酸＞EDTA＞亞硫酸氫鈉。

毛酸漿；多酚氧化酶；酶學特性

毛酸漿，俗稱菇蔦、甜菇娘、黃菇娘等，屬茄科酸漿屬草本植物，成熟時為黃色，因此有“黃菇娘”之稱。原產(chǎn)于南美洲，是黑龍江的特產(chǎn)。果實成熟時外形圓潤，色澤金黃，香甜可口，既是芳香甜美的水果，又是營養(yǎng)豐富的補品[1]，深受人們喜愛。然而，毛酸漿在加工過程中，容易發(fā)生酶促褐變，影響毛酸漿加工品質(zhì)及外觀品質(zhì)。研究表明，果蔬酶促褐變是由果蔬內(nèi)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）與多酚類物質(zhì)接觸，催化酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成醌，而醌又進一步聚合成黑色素所致[2-3]。因此，多酚氧化酶活力是決定果蔬組織褐變程度的重要因素之一，對多酚氧化酶特性的研究就成了解決褐變問題的重點所在。目前，關(guān)于果蔬類多酚氧化酶已有廣泛研究[4-7]。作者對毛酸漿多酚氧化酶的活性進行研究，并考察不同抑制劑對其PPO的抑制效果，旨在為控制毛酸漿加工過程中酶促褐變提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料毛酸漿：市售。

1.1.2 試劑檸檬酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚、抗壞血酸、L-半胱氨酸、EDTA、亞硫酸氫鈉：均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器ALC-210.2型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；TGL-16G型離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；201306454型可見分光光度計：上海佑科儀器儀器有限公司產(chǎn)品；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；PB-10型pH計：Sartorius產(chǎn)品；HC-TP11-10型天平：上海精科天平產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛酸漿PPO的提取稱取果肉15.0 g，加入0.05 mol/L pH 7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液15.0 mL，冰浴下快速研磨至勻漿，低溫13 000 r/min離心10 min，取上清液即為毛酸漿PPO粗酶液。

1.2.2 毛酸漿PPO活性的測定取pH 7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液0.5 mL，0.02 mol/L鄰苯二酚2.0 mL，混勻，36℃保溫10 min后迅速加入0.5 mL PPO粗酶液，酶液加入后開始計時。以0.5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液加2.0 mL鄰苯二酚加去離子水對照。在420 nm下每隔10 s測一次吸光值，共240 s，重復測3次，以每分鐘吸光度改變0.001所需酶量為1個活力單位。酶活力計算公式為：XPPO= U/V

式中：U為酶活力（U）；V為粗酶液體積（mL）。

1.2.3 pH對毛酸漿PPO活性的影響配制pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0系列磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，酶反應液組成和酶活力測定條件同1.2.2，確定PPO作用的最適pH條件。

1.2.4 溫度對毛酸漿PPO活性的影響取最適pH條件下磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液0.5 mL和0.02 mol/L鄰苯二酚溶液2.0 mL，混勻，分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃保溫10 min，取出后迅速加入0.5 mL酶液，按照1.2.2方法測定相對酶活力，確定PPO作用的最適溫度。

1.2.5 毛酸漿PPO的熱穩(wěn)定性取PPO粗酶液0.5 mL與最適pH條件下的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液3.5 mL，混勻，分別在80、90、100℃水浴中分別處理1、2、3、4、5 min后，冷卻至室溫，按1.2.2方法測定PPO的相對酶活力。

1.2.6 底物濃度對毛酸漿PPO活性的影響分別以濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的鄰苯二酚作為底物，在最適pH條件下按照1.2.2方法測定PPO的相對酶活力，確定PPO作用的最適底物濃度。根據(jù)Linewear-Burk雙倒數(shù)作圖法求得米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。

1.2.7 抑制劑對毛酸漿PPO活性的影響用最適pH的磷酸鹽緩沖溶液配制檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸溶液（質(zhì)量濃度皆為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L）、EDTA溶液（0.005、0.01、0.015、0.02、0.025 g/L），依次加入最適pH條件下的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液0.5 mL、最適濃度鄰苯二酚溶液1.0 mL、各不同濃度抑制劑0.5 mL和PPO粗酶液0.5 mL，按照1.2.2方法測定PPO相對酶活力。以不加抑制劑所測酶活力為100%，計算PPO相對酶活力。

1.2.8 預煮時間的確定分別稱取6份15 g的毛酸漿，1份直接測定PPO活力，其余5份分別投入沸水中預煮1、2、3、4、5 min，冷卻后在最適pH值下按照1.2.2方法測定PPO相對酶活力。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析每個實驗重復3次，利用Microsoft Excel軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計算標準偏差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛酸漿PPO酶活性的測定

從圖1可知，在反應最初30 s內(nèi)，相對酶活力幾乎成線性增長，說明初始階段PPO反應很快，當反應時間達30 s后，相對酶活力上升緩慢并趨于平穩(wěn)，反應時間超過30 s后，酶的活性不能由反應進程完全表征出來，因此確定反應時間30 s為最佳。

圖1 毛酸漿PPO反應進程曲線Fig.1 Enzymatic reaction curve of PPO from Physalis pubescens L.

2.2 pH值對毛酸漿PPO相對酶活的影響

從圖2可知，毛酸漿PPO活性對pH的變化較為敏感，當pH＜7.0時，隨pH升高多酚氧化酶的活性逐漸增大，在pH=7.0時毛酸漿PPO表現(xiàn)出最大活性，pH＞7.0時，酶活性隨pH的升高又逐漸下降，當pH=8時，毛酸漿PPO相對酶活力較低僅為30.34%。這可能是由于PPO是一種含銅蛋白質(zhì)，在強酸條件下，酶中的銅離子解離出來使酶失活；在堿性環(huán)境中，銅離子以Cu（OH）2形式沉淀出來，使酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使其活性降低。因此，在加工過程中，可以通過調(diào)節(jié)pH抑制PPO活性，減輕毛酸漿酶促褐變程度。

圖2 pH對毛酸漿PPO活性的影響Fig.2 Effect of pH on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.3 溫度對毛酸漿PPO相對酶活的影響

從圖3可知，毛酸漿PPO活性受溫度影響較大，隨著溫度的增加，毛酸漿PPO相對酶活先增加后降低，在40℃時達到最大值。當溫度為30℃時，酶活性為最高活性的67.32%，當溫度升至70℃，酶活力性為最高活性的52.83%，相對酶活較低。原因是毛酸漿PPO在最適溫度才能被完全激活，而升高溫度對酶蛋白結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性造成了破壞，從而引起毛酸漿PPO酶活降低。因此，毛酸漿PPO的最適反應溫度是40℃。

圖3 溫度對毛酸漿PPO活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.4 毛酸漿PPO的熱穩(wěn)定性

高溫可以使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變而發(fā)生變性，從而使毛酸漿PPO活性降低，使毛酸漿相關(guān)產(chǎn)物褐變程度降低。

從圖4可知，毛酸漿PPO經(jīng)不同高溫熱處理時，相對酶活力均隨熱處理時間的延長而下降，且溫度越高，熱處理對PPO的破壞作用越大。分別在80℃、90℃處理 3 min，PPO相對酶活依次為20.33%、10.67%，而在100℃處理3 min，PPO殘留活性為0.67%，表明PPO酶活性已完全喪失。因此，在毛酸漿加工中，可采用100℃熱處理3 min的方法來鈍化毛酸漿PPO，從而達到抑制褐變的目的。

圖4 熱處理對毛酸漿PPO活性的影響Fig.4 Effect of heat treatment on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.5 底物濃度對毛酸漿PPO活性的影響

由圖5可知：當?shù)孜餄舛葹?.02～0.04 mol/L時，酶活增加幅度幾乎呈線性關(guān)系。當濃度為0.04～0.06 mol/L時，酶活性的變化趨于平緩，在底物濃度為0.06 mol/L時酶活達到最大值。這說明該酶促反應存在一個適宜的底物用量，當?shù)孜餄舛冗_到這一適宜值時，再增加底物濃度對酶的活性作用不大，反而濃度太高會使酶活下降。因此底物濃度與PPO活性的關(guān)系遵循Michealis-Menten的酶促動力學。根據(jù)Line-weaver-Burke方程，以1/［S］為橫坐標，1/V為縱坐標作圖，如圖6所示，擬合直線相關(guān)系數(shù)達到0.987 3，求得米氏常數(shù)Km=0.025 mol/L，最大反應速率Vmax=125 U/min。

圖5 底物質(zhì)量分數(shù)對PPO酶反應速度的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

圖6 毛酸漿PPO的Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk plotofenzyme-catalyzed reaction of PPO from Pleurotus eryngii Quel

2.6 抑制劑對毛酸漿PPO相對酶活的影響

2.6.1 抗壞血酸對毛酸漿PPO活性的影響抗壞血酸是強還原劑，主要通過3方面作用：將酚的氧化產(chǎn)物醌還原成酚；與酶分子中的Cu2+螯合，使PPO失活；作為競爭性抑制劑，部分替代果蔬中的酚類物質(zhì)，自身被PPO氧化[8]對毛酸漿PPO的活性進行抑制，從而抑制褐變。

由圖7可知，隨著抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加，毛酸漿PPO相對酶活力明顯減小，當抗壞血酸質(zhì)量濃度達到0.04 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力僅為1.37%，表明抗壞血酸可對PPO活力產(chǎn)生顯著的抑制作用。

近年來，隨基夫賽特爐日處理量不斷提升，導致煙化爐處理量增加，進而引發(fā)鍋爐熱負荷增加，其中鍋爐入口煙氣溫度設計值為1200±100℃、最大產(chǎn)氣量為40.8t/h，但是實際生產(chǎn)過程中鍋爐入口煙氣溫度達到了1375℃、最大產(chǎn)氣量達到了50t/h，溫度高會導致以下問題。

圖7 抗壞血酸質(zhì)量濃度對毛酸漿PPO活性的影響Fig.7 Effect of ascorbic acid on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.6.2 檸檬酸對毛酸漿PPO活性的影響檸檬酸作為1種螯合劑，其3個羧基對毛酸漿PPO的銅離子有較強的螯合作用，可形成配位體化合物而使毛酸漿PPO酶失活。另外，檸檬酸對反應體系的pH值有調(diào)節(jié)作用，使之遠離毛酸漿PPO最適pH而降低活性。

由圖8可知，隨著檸檬酸質(zhì)量濃度的增加，毛酸漿PPO相對酶活力逐漸減小，當檸檬酸質(zhì)量濃度達0.04 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力為19.33%，質(zhì)量濃度達0.05g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力為17.33%。

圖8 檸檬酸對毛酸漿PPO活性的影響Fig.8 Effect of citric acid on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.6.3 L-半胱氨酸對毛酸漿PPO活性的影響L-半胱氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，無毒、無副作用，不存在食品安全問題，是一種理想的天然抗酶促褐變物質(zhì)。

由圖9可知，隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增大，毛酸漿PPO相對酶活力逐漸降低。L-半胱氨酸濃度達到0.015 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力為32.67%，當L-半胱氨酸質(zhì)量濃度達到0.025 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力仍為20.43%，表明L-半胱氨酸對毛酸漿PPO酶活力有抑制效果，但抑制效果相對抗壞血酸和檸檬酸較差。

圖9 L-半胱氨酸質(zhì)量濃度對毛酸漿PPO活性的影響Fig.9 Effect of L-Cysteine on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.6.4 EDTA對毛酸漿PPO活性的影響EDTA作為一種螯合劑，可以與毛酸漿PPO中銅離子形成配位體化合物而使毛酸漿PPO酶失活。

由圖10可知，隨著EDTA濃度的濃度的增加，毛酸漿PPO活力緩慢減小，當EDTA質(zhì)量濃度達到0.04 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力為45.33%，質(zhì)量濃度達到0.05 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力為42.58%。說明EDTA質(zhì)量濃度為0.05g/L時護色效果最佳，但相比其他抑制劑，EDTA抑制效果不明顯，與張福平[9]等的研究結(jié)果也類似。

圖10 EDTA對毛酸漿PPO活性的影響Fig.10 Effect of EDTA on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

由圖11可知，隨著NaHSO3質(zhì)量濃度的增大PPO活力降低緩慢。當NaHSO3質(zhì)量濃度達到0.05 g/L時，毛酸漿PPO相對酶活力仍為66.67%，說明NaHSO3對毛酸漿的護色效果遠不如其他幾種抑制劑。并且由于NaHSO3有漂白作用，可產(chǎn)生不良異味，破壞營養(yǎng)，使組織軟化，且有害健康，美國FDA已對其使用作出限制[10]。

圖11 NaHSO3對毛酸漿PPO活性的影響Fig.11 Effect of NaHSO3on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.7 預煮對毛酸漿PPO相對酶活的影響

熱燙預煮的主要目的是殺死微生物和破壞多酚氧化酶酶的活性，防止毛酸漿濁汁在加工過程中變色、變味和營養(yǎng)成分的損失，從而提高產(chǎn)品的保質(zhì)期[11-12]。

預煮時間對毛酸漿PPO相對酶活力的影響如圖12所示，隨著加熱時間的延長，PPO活性不斷降低。100℃加熱1 min，毛酸漿PPO相對酶活力降低為9.56%，加熱2 min，毛酸漿PPO相對酶活力為0.61%，加熱3min毛酸漿PPO相對酶活力降為0.53%。

圖12 預煮時間對毛酸漿PPO活性的影響Fig.12 Effect of heat treatment on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

3 結(jié)語

毛酸漿PPO底物鄰苯二酚的最適濃度為0.04 mol/L，最適pH為6.0，最適溫度為35℃，在100℃高溫條件下熱處理3 min，整果在100℃預煮2 min，PPO酶活幾乎完全喪失。

動力學研究表明，以鄰苯二酚為底物時，底物濃度與毛酸漿 PPO活性的關(guān)系遵循 Michealis-Menten的酶促動力學方程，得到米氏常數(shù)Km=0.025 mol/L，最大反應速率Vmax=125 U/min。

5種常用的酶活抑制劑對毛酸漿PPO的抑制效果均隨著濃度的增大而加強，抑制能力由強到弱依次為：抗壞血酸＞檸檬酸＞L-半胱氨酸＞EDTA＞亞硫酸氫鈉，抗壞血酸對毛酸漿PPO活性的抑制效果最好，當濃度達到0.04 mol/L時，PPO活性可完全得到抑制。

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Study on Enzymatic Characteristics of Polyphenol Oxidase from Physalis pubescens L.

GAO Xinxin， WEI Zhen， CHANG Chen， LIU Junkun， WANG Ping*
（College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The enzymatic characteristics of polyphenol oxidase（PPO）from Physalis pubes-cens L. was studied by spectrophotometer at 420 nm.The results showed thatthe PPO enzyme had the highest activity at pH 7.0 and 35℃ and the enzyme activity would been inactivated completely after exposure to 100℃for 2 min.The kinetics of enzyme-catalyzed reaction of PPO was in accord with Michaelis-Menten equation，with Kmand Vmax values of 0.025 mol/L and 125 U/min，respectively.In the range designated，it was increasing in inhibitory effects of ascorbic acid，citric acid，NaHSO3，L-Cysteine and EDTA against enzyme activity with the increasing concentration，and the order as follow：ascorbic acid＞citric acid＞L-cysteine＞EDTA＞NaHSO3.

Physalis pubescens L.，polyphenol oxidase（PPO），enzymatic characteristics

Q 554

A

1673—1689（2015）01—0102—06

2014-04-19

國家級大學生創(chuàng)新實驗項目（201310225012）。

*通信作者：王 萍（1964—），女，黑龍江伊春人，工學博士，教授，主要從事植物活性物質(zhì)研究。E-mail：949508700@qq.com