人子宮內(nèi)膜異位癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分離與培養(yǎng)

黃冬花，張曉玲，陳美紅

(江西省婦幼保健院，南昌 330006)

·技術(shù)與方法·

人子宮內(nèi)膜異位癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分離與培養(yǎng)

黃冬花，張曉玲△，陳美紅

(江西省婦幼保健院，南昌 330006)

目的 建立子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)異位、在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的體外細(xì)胞模型，實(shí)時觀察間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。方法膠原酶消化異位、在位內(nèi)膜組織，二次篩網(wǎng)過濾結(jié)合低速離心法分離純化間質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀況及細(xì)胞形態(tài)差異。結(jié)果培養(yǎng)成功率91.3%，間質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95%；異位間質(zhì)細(xì)胞9代內(nèi)、在位及對照組間質(zhì)細(xì)胞11代內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)及活性并無明顯改變。結(jié)論子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞可為子宮內(nèi)膜異位癥研究提供較好的細(xì)胞模型。

子宮內(nèi)膜異位癥；間質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；二次篩網(wǎng)過濾法

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指具有生長活性的子宮內(nèi)膜組織在子宮腔披覆內(nèi)膜、肌層以外的其他部位。從發(fā)現(xiàn)EMs至今，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制有多種理論，但尚無一個滿意的解釋。對EMs的研究仍任重道遠(yuǎn)，一個好模型對其研究必不可少。近年來由于動物及人體模型存在較大差異且受到倫理學(xué)的限制，體外模型已成為EMs研究的熱點(diǎn)。本研究目的是分離培養(yǎng)EMs患者異位、在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，為進(jìn)一步探討EMs發(fā)病機(jī)制和治療藥物篩選提供一個有價值的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 資料與方法

1.1 一般資料 卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(OEMs)組：2012年 9 月至2013年1月在江西省婦幼保健院婦科住院接受腹腔鏡手術(shù)的OEMs患者，年齡20～39歲，取患者子宮內(nèi)膜及囊壁各8例(子宮內(nèi)膜病理為正常增生期、囊壁病理確診為OEMs)。對照組：本院同期確診為非EMs的卵巢良性畸胎瘤的患者，年齡21～40歲，取患者的子宮內(nèi)膜7例(子宮內(nèi)膜病理為正常增生期)。所有患者月經(jīng)規(guī)律，術(shù)前6個月無甾體類激素治療史，排除腫瘤病史，無生殖道炎癥和放置宮內(nèi)節(jié)育器史，非妊娠或哺乳期。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基(賽默飛)，胎牛血清(四季青)，膠原酶Ⅳ、多聚甲醛(Solarbio)，青霉素鏈霉素混合液(Notlas)，0.25%胰蛋白酶(Biotopped)，鼠抗波形蛋白單抗、鼠抗人角蛋白單抗、免疫組化檢測試劑盒及DAB試劑盒(中杉金橋)。SW-CJ-IF型凈化工作臺，MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱，Olympus倒置顯微鏡，水浴箱，低速離心機(jī)，細(xì)胞計數(shù)板。

1.3 方法

1.3.1 取材 將術(shù)中取得的組織放入預(yù)冷的裝有無菌PBS液的廣口瓶中，放置冰盒內(nèi)，立即送回實(shí)驗(yàn)室(30 min內(nèi))處理。

1.3.2 細(xì)胞原代培養(yǎng) 將組織用PBS液清洗3次，去除血塊；在培養(yǎng)皿中用眼科剪剪碎，約1 mm3；加入9 mL無血清培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，移至離心管中，加入1 mL 0.1%Ⅳ型膠原蛋白酶，37 ℃水浴箱中消化60 min，每10～15分鐘搖晃1次；見組織呈絮狀，即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，充分吹打；分別用80目(孔徑220 μm)、300目(孔徑50 μm)篩網(wǎng)過濾1次，將最終過濾液放入離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)基充分混勻后置于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2 h后進(jìn)行第1次細(xì)胞換液；第2天再次換液，以后每隔1日換液。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 傳代培養(yǎng) 當(dāng)培養(yǎng)瓶細(xì)胞長滿80%～90%時，行傳代培養(yǎng)。去除培養(yǎng)基，PBS洗2遍；加入700 μL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化1～2 min，顯微鏡見70%～80%細(xì)胞變圓形，加入5 mL含血清的培養(yǎng)液終止消化；充分吹打，細(xì)胞計數(shù)，約5×105/mL接種至新瓶，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞鑒定 將細(xì)胞按1×106/mL接種于6孔板中培養(yǎng)；細(xì)胞長滿70%～80%，行細(xì)胞鑒定。4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；3% H2O2室溫封閉10 min；分別加入波形蛋白單抗、角蛋白單抗、空白對照加入PBS液，37 ℃ 1 h；滴二抗：滴加試劑A，37 ℃ 15 min，滴加劑B，37 ℃ 15 min；滴加DAB顯色5 min；用dddH2O充分清洗，洗到空白孔無色為止；以細(xì)胞質(zhì)或核呈現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞，在倒置顯微鏡低倍鏡下隨機(jī)取5個視野，采用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的加方網(wǎng)Gundersen測試系統(tǒng)計數(shù)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目及總細(xì)胞數(shù)目，計算分離得到的內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞純度。

2 結(jié) 果

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 23例標(biāo)本中，21例(91.3%)標(biāo)本培養(yǎng)成功，1例異位和1例對照組標(biāo)本因細(xì)菌污染失敗。

2.2 間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 新分離的3組內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞外觀特征相似，懸浮液中呈單個細(xì)胞，形態(tài)呈圓形或橢圓形；貼壁后呈梭形生長，少部分呈星形生長，細(xì)胞質(zhì)薄且透明，細(xì)胞核圓形居中，細(xì)胞平鋪生長，無明顯極性。細(xì)胞培養(yǎng)過程中見異位間質(zhì)細(xì)胞比在位、正常細(xì)胞稍大，形態(tài)仍是梭形或星形。

2.3 間質(zhì)細(xì)胞生長情況 分離的內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞30 min后部分細(xì)胞開始貼壁，24 h后大部分間質(zhì)細(xì)胞已貼壁。在位、對照組間質(zhì)細(xì)胞生長速度較快，2～3 d傳代1次；異位間質(zhì)細(xì)胞生長速度相對較慢，4～5 d傳代1次(細(xì)胞傳代后生長形態(tài)見圖1)。在位、對照組間質(zhì)細(xì)胞11代內(nèi)，異位間質(zhì)細(xì)胞9代內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)及活性并無明顯改變，若繼續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)增大，胞質(zhì)中含有顆粒，細(xì)胞出現(xiàn)崩解現(xiàn)象，在相同的消化條件下，裂解的細(xì)胞數(shù)目較多。

2.4 間質(zhì)細(xì)胞鑒定 間質(zhì)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子為波形蛋白，腺上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志分子為細(xì)胞角蛋白。細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示：內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞波形蛋白陽性著色(棕黃色)，角蛋白及空白對照未著色，間質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95%(圖2)。

A:對照組;B:異位組;C:在位組。

圖1 各組間質(zhì)細(xì)胞傳代后生長形態(tài)

A：波形蛋白組；B：角蛋白組；C：空白組。

圖2 各組細(xì)胞化學(xué)免疫鑒定結(jié)果

3 討 論

3.1 體外培養(yǎng)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對EMs研究的意義 近年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，可以觀察細(xì)胞生長分化、增生、侵襲及轉(zhuǎn)移等情況，還能進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、分子生物學(xué)方面及藥物作用機(jī)制方面的研究。建立體外EMs異位、在位間質(zhì)細(xì)胞模型，可對EMs的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行基礎(chǔ)研究，并可為研究其藥物治療作用機(jī)制提供有效手段。

3.2 EMs異位、在位細(xì)胞體外培養(yǎng)方法 間質(zhì)細(xì)胞生長活性及傳代與間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及純度密切相關(guān)[1]，國內(nèi)外子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的分離純化方法卻不盡相同。間質(zhì)細(xì)胞的獲取主要利用化學(xué)分離和物理分離法。化學(xué)分離即酶消化法：有胰蛋白酶和膠原酶消化兩種，胰蛋白酶消化可裂解大部分內(nèi)膜組織，但消化過程中可觀察到細(xì)胞懸液中有絮狀物，細(xì)胞懸液黏度大，影響所得細(xì)胞數(shù)量。膠原酶一般消化30～90 min，不影響細(xì)胞懸液黏滯度，但消化時間較為關(guān)鍵，消化不完全時，難以獲得完全單細(xì)胞懸液，而消化過度所得細(xì)胞活性差，不易細(xì)胞培養(yǎng)。物理分離法則包括離心法、重力沉降法及篩網(wǎng)過濾法。最初學(xué)者們利用低速離心或重力沉降法，但所得細(xì)胞純度較低[2]，目前此法較少單獨(dú)應(yīng)用。篩網(wǎng)過濾法有一次濾網(wǎng)過濾和二次篩網(wǎng)過濾法[3-5]。人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞直徑約40 μm,腺上皮細(xì)胞直徑約70 μm，篩網(wǎng)過濾法是根據(jù)這兩種細(xì)胞大小的差異來過濾分離。許艷麗等[6]發(fā)現(xiàn)經(jīng)篩分離的間質(zhì)細(xì)胞單層匯聚時間短于離心分離。李妍等[7]利用篩網(wǎng)分離和離心分離兩種方法結(jié)合發(fā)現(xiàn)可以有效地把細(xì)胞分離純化。

本研究在總結(jié)眾多分離方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，采用消化、二次篩網(wǎng)過濾、低速離心和選擇性貼壁4步法，間質(zhì)細(xì)胞獲得率和純度令人滿意。采用0.1%膠原酶37 ℃消化60 min，每間隔15 min搖勻1次。水浴37℃，可提高膠原酶活性，聯(lián)合間歇性將消化液與組織充分混勻，使細(xì)胞消化完全，該酶消化下的細(xì)胞活性較好、細(xì)胞純度更高，方法較王海燕等[8]報道的精簡。隨后利用80目(孔徑約220 μm)的濾網(wǎng)除先去除未消化完的組織團(tuán)塊，再過濾300目(孔徑約50 μm)篩網(wǎng)將腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞分開；之后將濾液低速離心；最后利用間質(zhì)細(xì)胞分離30 min開始貼壁、腺上皮細(xì)胞分離2 h開始貼壁，以及紅細(xì)胞不貼壁的性質(zhì)，將細(xì)胞重懸培養(yǎng)2 h后進(jìn)行首次換液，去除腺上皮及紅細(xì)胞，提高細(xì)胞純度，并為間質(zhì)細(xì)胞營造良好的生長環(huán)境。最終所得間質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95%，細(xì)胞活性好，在位、對照組間質(zhì)細(xì)胞2～3 d傳代1次，異位間質(zhì)細(xì)胞4～5 d傳代1次。且發(fā)現(xiàn)異位細(xì)胞9代內(nèi)，在位組、對照組間質(zhì)細(xì)胞傳到11代內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)及活性并無明顯改變，結(jié)果優(yōu)于廉紅梅等[9]的報道。說明本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合改良法在獲得足夠細(xì)胞數(shù)量的同時保證了較高的細(xì)胞純度，有助于細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代進(jìn)行。

3.3 EMs異位、在位細(xì)胞體外培養(yǎng)注意事項(xiàng) 目前異位、在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)成功率并不高，尤其是異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)成功較低，所以要成功建立體外培養(yǎng)模型，除了選擇一個好的分離純化方法外，在標(biāo)本的選擇及分離操作細(xì)節(jié)上也尤為重要。(1)月經(jīng)周期：子宮內(nèi)膜組織中含更多間質(zhì)細(xì)胞的患者易發(fā)生EMs[10]。不同月經(jīng)周期中，細(xì)胞含量不同，增殖期以間質(zhì)細(xì)胞為主，分泌期以上皮細(xì)胞為主。要獲取足夠間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)選擇月經(jīng)增殖期內(nèi)膜組織。(2)取材：腹膜紅色病變處內(nèi)膜細(xì)胞含量高，但標(biāo)本難以取得，目前較多是選OEMs囊壁。OEMs囊腫大，細(xì)胞含量少；褐色處的囊壁組織一般為陳舊性出血灶，而淡黃色處囊壁組織相對新鮮，尤其是肉眼可見絨毛樣組織標(biāo)本，細(xì)胞數(shù)量多。故最好選擇4～5 cm囊腫，取淡黃色處的囊壁或肉眼見絨毛樣的組織。(3)去除紅細(xì)胞：標(biāo)本中混雜的紅細(xì)胞破裂后釋放的酶會影響培養(yǎng)液環(huán)境，取材時應(yīng)盡量刮除內(nèi)膜表面的黏液及血塊，并用PBS液清洗3次，盡可能去除血塊。接種2 h后進(jìn)行細(xì)胞換液，也可去除不貼壁的紅細(xì)胞。(4)消化時間短于30 min,獲得細(xì)胞數(shù)目少；細(xì)胞消化時間過長、消化酶濃度過高均會損傷細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用0.1%膠原酶消化60 min，間質(zhì)細(xì)胞含量高，細(xì)胞純度較高。(5)離心：離心次數(shù)過多、轉(zhuǎn)速過高，均可導(dǎo)致細(xì)胞破裂、細(xì)胞丟失及影響細(xì)胞活性。本研究中，離心次數(shù)不超過2次，離心轉(zhuǎn)速不超過1 000 r/min。(6)抗生素使用：標(biāo)本在采取的過程可能存在污染，尤其是在位內(nèi)膜和對照組內(nèi)膜，故在培養(yǎng)液中加入一定量的抗生素，避免細(xì)菌污染。

總之，本研究采用膠原酶消化、二次篩網(wǎng)過濾法和離心法相結(jié)合獲得較高純度和較多數(shù)量的EMs異位、在位間質(zhì)細(xì)胞，可為EMs的研究提供滿意的體外細(xì)胞模型。

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Isolation and culture of human ectopic and eutopic endometrial stromal cells

HuangDonghua,ZhangXiaoling△,ChenMeihong

(JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To establish the in vitro cell model of ectopic and eutopic endometrial stromal cells in endometriois(EMs) for conducting the real time observation on the morphological changes of stromal cells.Methods The ectopic and eutopic endometrial stromal cells were digested by collagenase,isolated and purified by the quadratic sieve filtration combined with the low speed centrifugation.The cells were identified by the immunohistochemistry staining.The cells passage culture was performed.The cells growth condition and differences in cell morphology were observed.Results The culture success rate of endometrial stromal cells was 91.3%.The stromal cells purity reached 95%.The cell morphology and activity had no obvious changes for the ectopic endometrial stromal cells within 9 generations,and the eutopic endometrial stromal cells and the control stromal cells within 11 generations.Conclusion The endometrial stromal cells can provide better cell model for the research of EMs.

endometriosis;stromal cells;cell culture;quadratic sieve filtration method

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.024

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012BAB205011)

黃冬花(1988-)，碩士研究生，主要從事子宮內(nèi)膜異位癥方面的研究。

△通訊作者，E-mail:xlzzz777@126.com。

R329.2

A

1671-8348(2015)15-2084-03

2014-10-28

2015-02-26)