犬重度心肌挫傷動物模型的建立及其應(yīng)用價(jià)值

張為民，趙興吉△，杜文華，熊秀勤

(1．重慶市急救醫(yī)療中心胸心外科 400014；2．第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院

論著·基礎(chǔ)研究

犬重度心肌挫傷動物模型的建立及其應(yīng)用價(jià)值

張為民1，趙興吉1△，杜文華2，熊秀勤2

(1．重慶市急救醫(yī)療中心胸心外科 400014；2．第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院

野戰(zhàn)外科研究所超聲診斷科，重慶 400042)

目的 建立犬重度心肌挫傷(MC)的動物模型。方法選用12只犬，體質(zhì)量(11.36±1.50)kg，采用直接撞擊犬左胸前裸區(qū)，設(shè)置驅(qū)動壓為800 kPa，撞擊面積16.61 cm2，胸壁向內(nèi)壓縮4～6 cm，建成MC模型。傷后8 h行病理檢查，根據(jù)簡明損傷定級標(biāo)準(zhǔn)(AIS,2005更新本)中MC的傷情評定方法進(jìn)行分級。結(jié)果受創(chuàng)區(qū)心外膜、心內(nèi)膜出現(xiàn)散在大面積出血斑，未受創(chuàng)區(qū)無明顯異常。以左心室橫向切開冠狀面病理檢測，切面8 h壞死面積占總面積的(39.78±9.07)%，為重度MC。結(jié)論該研究中所建立的犬重度MC模型穩(wěn)定和可重復(fù)性好，能夠較準(zhǔn)確模擬臨時MC模型。

心肌挫傷；出血；撞擊傷

創(chuàng)傷是目前年輕人死亡的主要原因，約占普通人群死亡的1/3。因胸部創(chuàng)傷而死亡的患者大約占25%，其中因交通事故所致心臟創(chuàng)傷而死亡的人數(shù)又占20%[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在胸部鈍性損傷(blunt chest trauma,BCT)中，心肌挫傷(myocardial contusion，MC)發(fā)生率報(bào)道差別很大，可以是7%～71%[3]；臨床表現(xiàn)較多為輕微的心電圖異常，臨床上因MC導(dǎo)致心臟破裂而死亡的病例并不少見，臨床診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，許多MC患者常常死于心律失常、低血壓、心臟壓塞、心源性休克、心臟破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥，常常在死亡后尸檢中發(fā)現(xiàn)MC[4]。目前雖然對MC的報(bào)道較多，但診斷極為困難，主要的原因是對其重視不夠。而相關(guān)的研究也較少，最主要的原因是缺乏穩(wěn)定且科學(xué)可靠的動物模型。本研究將重點(diǎn)探討重度MC模型的建立方法，并分析其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 模型的制備

1.1.1 致傷設(shè)備 BIM-Ⅱ型生物撞擊機(jī)主要包括4部分：氣炮、撞擊錘及其固定架、檢測系統(tǒng)。氣炮由高壓源、氣室、閥門、炮管和炮彈組成。撞擊錘有不同面積、可根據(jù)需要建成不同致傷模式。致傷過程：首先將撞擊錘固定好。調(diào)整動物體位，選擇撞擊部位，根據(jù)需要選擇不同的撞擊頭，打開電源，推動撞擊錘，撞擊動物。

1.1.2 撞擊參數(shù)的設(shè)置 驅(qū)動壓800 kPa，撞擊面積16.61 cm2，胸壁向內(nèi)壓縮4～6 cm，臥式準(zhǔn)靜態(tài)撞擊。

1.1.3 具體方法 選用健康雜種犬12只(由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動物中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量(11.36±1.50)kg,用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈注射麻醉。采用撞擊機(jī)撞擊犬左胸前裸區(qū)，撞擊中心點(diǎn)為超聲定位左室短軸切面心包裸區(qū)，臥位準(zhǔn)靜態(tài)撞擊(見圖1)。驅(qū)動壓800 kPa、撞擊面積16.61 cm2、胸壁內(nèi)壓縮4～65 cm建成犬MC模型，常規(guī)心電圖監(jiān)測。其中2只分別于傷后1、4 h出現(xiàn)心室顫動而死亡，在下文實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。

1.2 病理活檢與損傷范圍檢定 傷后8 h用10%的KCl處死犬，取出心臟，先行大體標(biāo)本觀察，然后沿左心室橫向剪開心臟，冠狀面分層，每個層面厚5 mm，用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色(37 ℃，20 min)。TTC染色后正常心肌呈紅色，缺血心肌呈暗磚紅色，壞死心肌仍呈心肌原蒼白色。將經(jīng)TTC染色后的病理切片攝像輸入計(jì)算機(jī)，采用Photoshop軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析、測量左心室橫向切開計(jì)算冠狀面總面積(TA1)及TTC染色顯示壞死面積(A1)，并計(jì)算A1/ TA1比值。并取部分心肌組織常規(guī)10%甲醛固定，HE染色，光鏡觀察。

圖1 撞擊實(shí)驗(yàn)時動物致傷體位與撞擊機(jī)

2 結(jié) 果

2.1 大體病理檢查 受創(chuàng)區(qū)心外膜、心內(nèi)膜出現(xiàn)散在大面積出血斑，未受創(chuàng)區(qū)無明顯異常(圖2)。最常見部位依次為心尖部、室間隔及近頭肌處、左心房、右心室和右心房。心尖部可見片狀心肌實(shí)質(zhì)出血，主動脈根部可見淤血，未見室間隔穿孔及主動脈、肺動脈根部破裂，冠狀動脈內(nèi)未見血栓形成。

2.2 顯微病理檢查 心肌組織可見廣泛充血及多灶性出血，心肌細(xì)胞腫脹，損傷范圍不規(guī)則，心內(nèi)膜下及心肌組織間見大量的紅細(xì)胞，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤，部分心肌纖維斷裂(圖3)，心肌大片狀出血灶。

2.3 TTC染色檢查 心臟各腔、室壁可見損傷不規(guī)則的心肌實(shí)質(zhì)缺血區(qū)與壞死區(qū)，可見少許透壁性心肌全層壞死損傷區(qū)，以左心室心尖部、室間隔肌層最重，乳頭肌損傷以缺血為主(圖4)。右心室壁壞死較重。本實(shí)驗(yàn)以左心室乳頭肌橫斷面為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理檢測，左心室短軸切面壞死面積占總面積的(39.78±9.07)%。病理所測傷后8 h心肌壞死面積及其所占總面積的百分比，見表1。

圖2 心內(nèi)膜下廣泛的點(diǎn)狀出血

圖3 MC后心肌纖維斷裂(HE×400)

表1 病理所測傷后8 h心肌壞死面積及其所占總面積的百分比

A1：左心室短軸切面心肌壞死面積；TA1：左心室短軸切面心肌的總面積；A1/TA1：左心室短軸切面心肌壞死面積占該切面心肌總面積的百分比。

3 討 論

3.1 MC模型的建立 有關(guān)心臟撞擊傷動物MC模型的文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)較多，多著重探討MC后心律失常的變化規(guī)律、血流動力學(xué)的改變及其生物力學(xué)機(jī)制，對MC后形態(tài)學(xué)的改變研究較少[5]。本實(shí)驗(yàn)主要探討MC后心臟及心肌形態(tài)學(xué)的改變。模型的建立方法各有不同，主要有直接撞擊和間接撞擊兩種。Guan等[6]以10.0 m/s直接撞擊犬胸前區(qū)，制成MC模型，病理檢查獲得成功，并為探討MC后血流動力學(xué)、心電圖的改變提供了良好的動物模型。杜文華等[7]采用直接撞擊家兔胸前區(qū)制成動物模型，通過病理檢測，效果較差，主要是家兔體型較小，定位困難，另外家兔心腔較小，心率較快，行二維超聲心動圖和彩色多普勒檢查非常不準(zhǔn)確，與臨床實(shí)際工作要求相差較大，該類動物模型研究價(jià)值較小。本實(shí)驗(yàn)采用超聲定位直接撞擊犬左胸前裸區(qū)，建成動物模型。結(jié)果表明超聲定位致傷部位準(zhǔn)確，致傷程度一致，可控性好，易于操作。病理活檢檢查證實(shí)：受創(chuàng)區(qū)心外膜、心內(nèi)膜出現(xiàn)散在大面積出血斑，未受創(chuàng)區(qū)無明顯異常。最常見部位依次為心尖部、室間隔及近頭肌處、左心房、右心室和右心房。心尖部可見片狀心肌實(shí)質(zhì)出血，主動脈根部可見淤血，未見室間隔穿孔及主動脈、肺動脈根部破裂，冠狀動脈內(nèi)未見血栓形成。TTC染色見左心室以室間隔、前壁、側(cè)壁損傷為主。部分動物有輕度肺表面片狀出血，面積較小，胸腔內(nèi)微量積血，未見肺破裂或氣胸，未見肝脾破裂傷，對動物的病理生理影響較小。因此，該動物模型更能準(zhǔn)確反映MC引起的病理生理改變，同時該動物模型致傷方法簡便簡單、可控性及重復(fù)性好，生理更符合人體，部位準(zhǔn)確，易于監(jiān)測及研究，能更好地滿足臨床研究的需要。

3.2 MC分級 關(guān)于MC的分級，目前臨床上尚無統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)。目前國內(nèi)外主要在形態(tài)學(xué)方面參考的簡明損傷定級標(biāo)準(zhǔn)(AIS，2005)中MC的分級標(biāo)準(zhǔn)，臨床上采用手術(shù)或尸檢證實(shí)：單一心肌裂傷，AIS分值為3分(較重度)；多發(fā)性裂傷，AIS分值為6分(極重度)?；蛘哜g性心臟傷致室性早搏連續(xù)(≥5次)或多灶性室性早搏，AIS分值為4分，心臟損傷定位Ⅲ級(較重度)。新近閔家新參考Lau 等[8]的方法對心臟鈍性傷的分級標(biāo)準(zhǔn)為：心血管系統(tǒng)有淤血點(diǎn)為1分；有散在性點(diǎn)灶狀出血為2分；出血面積小于10%為3分；出血面積10%～30%為4分；出血面積10～30%且有心肌出血為5分；大血管破裂或心包撕裂為6分。該分級方法可以直觀地估計(jì)心臟損傷的程度，具有方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)。但也存在標(biāo)準(zhǔn)單一，對心肌是否壞死及面積的大小缺乏病理證實(shí)，應(yīng)用存在一定的局限性。劉維永等[9]認(rèn)為重度MC的病理標(biāo)準(zhǔn)為：重度MC后4 h可見心肌纖維結(jié)構(gòu)完整性破壞，挫傷灶周圍充血、濁腫，嗜酸性粒細(xì)胞增加，橫紋肌消失，可見廣泛間質(zhì)出血，紅細(xì)胞散在或形成灶性分布于心肌纖維間，局部有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，部分可見心肌纖維斷裂，PMN大量浸潤及心肌內(nèi)微小血栓形成。有核仁裂解，細(xì)胞溶解等不可逆性損傷表現(xiàn)。心肌細(xì)胞損傷程度半定量分析：重度MC組心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷的百分比[(36.8±12.5)%]明顯高于輕度MC組[(15.3±5.4)%，P<0.01]。該分級標(biāo)準(zhǔn)客觀、真實(shí)。但缺乏臨床表現(xiàn)，難以準(zhǔn)確預(yù)測心肌挫傷后的并發(fā)癥及其傷后可能出現(xiàn)的高危因素。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所觀察到的動物損傷后的心電圖變化、大體病理及顯微病理改變、心肌不同截面損傷與壞死心肌占總面積的比值等，同時參照簡明損傷定級標(biāo)準(zhǔn)(AIS,2005)MC的傷情評定方法并參考文獻(xiàn)[9-10]關(guān)于重度MC的評定標(biāo)準(zhǔn)，對本實(shí)驗(yàn)中的動物傷情予以評分，其中1只犬因點(diǎn)狀出血，心尖部壞死面積小于30%，被評為3分；1只犬因傷后室性早搏，ST-T壓低超過1 mm，病理檢查發(fā)現(xiàn)為單一的心肌裂傷，壞死面積大于30%被評為3分；8只犬因廣泛的心外膜、心內(nèi)膜點(diǎn)或片狀出血，連續(xù)性室性早搏(≥5次/分鐘)或多灶性室性早搏，ST段弓背向上抬高，病理檢查發(fā)現(xiàn)左心室短軸切面壞死面積占總面積的百分比大于30%，被評為4分。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，所有傷后存活的10只動物的綜合平均創(chuàng)傷評分達(dá)到3.8分，完全符合重度損傷的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合MC后的心電圖表現(xiàn)及病理結(jié)果建立的分級標(biāo)準(zhǔn)，與臨床尸檢病例報(bào)到：鈍性心臟傷中左、右心室最易發(fā)生挫傷，包括：出血、肌纖維斷裂、壞死想一致[11]，更能較為準(zhǔn)確地預(yù)測傷后并發(fā)癥的發(fā)生及可能出現(xiàn)危及生命的高危因素，貼近臨床實(shí)際，適于MC機(jī)制與相關(guān)臨床診斷的研究。

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Animal model construction of dog severe myocardial contusion and its application value

ZhangWeimin1,ZhaoXingji1△,DuWenhua2,XiongXiuqin2

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,ChongqingEmergencyMedicalCenter,Chongqing400014,China;2.DepartmentofUltrasound,DapingHospital,ResearchInstituteofSurgeryThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To establish an animal model of dog severe myocardial contusion(MC).Methods 12 dogs with the body weight of (11.36±1.50)kg were selected.The BIM-Ⅱ type biological impact machine was adopted to directly impact the bare area of the left chest by the driving pressure of 800 kPa,the impact area was 16.61 cm2and the chest wall was inward compressed within 4-6 cm,the severe myocardial contusion model was established.The pathological examination was taken at 8 h after injury and grading was performed according to the Abbreviated Injury Scale (AIS,update in 2005).Results The scattered large area bleeding spots appeared in the epicardium and endocardium of wound area.No obvious abnormality was found in the non- wound area.The pathological examination was performed based on the coronal plane of the left ventricular cross section.The percentage of the section 8 h necrosis area to the total area was (39.78±9.07)%.Conclusion The established dog severe myocardial contusion model is stable and reproducible,which can accurately simulate the temporary MC mode.

myocardial contusion;hemorrhage;impact injury

張為民(1969-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胸心外科工作。

△通訊作者，E-mail:zxj60918@sina.com。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.007

A

1671-8348(2015)15-2037-03

2014-11-08

2015-02-16)