Pim-1在非小細胞肺癌中的表達及其與c-Myc的相關(guān)性

劉星宏，溫桂蘭

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 330006)

論著·基礎(chǔ)研究

Pim-1在非小細胞肺癌中的表達及其與c-Myc的相關(guān)性

劉星宏，溫桂蘭△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 330006)

目的 研究原癌基因Pim-1在非小細胞肺癌及癌旁正常組織中的表達情況及其與c-Myc的相關(guān)性。方法收集該院胸外科手術(shù)切除的非小細胞肺癌患者的肺癌及癌旁正常肺組織標(biāo)本各30例，統(tǒng)計臨床病例資料及跟蹤后期病理結(jié)果，利用RT-PCR、qRT-PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測肺癌及癌旁正常組織中Pim-1 mRNA、c-Myc及Pim-1蛋白的表達，分析Pim-1表達與臨床病理特征及c-Myc表達的相關(guān)性。結(jié)果在非小細胞肺癌中Pim-1陽性率、mRNA及蛋白表達量明顯高于癌旁組織，mRNA表達量分別為0.798±0.083 和0.394±0.107 (P<0.01)，蛋白陽性例數(shù)分別為18例及6例(P=0.002)。Pim-1蛋白的表達與非小細胞肺癌患者的年齡差距、性別差異、有無吸煙史、腫瘤病理類型及分化程度無關(guān)(P>0.05)，但與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的TNM分期有關(guān)(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期升高，其表達量也隨之上調(diào)。Pim-1與c-Myc蛋白表達呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)為0.433(P=0.017)。結(jié)論Pim-1在非小細胞肺癌組織中呈高表達趨勢，且隨著存在淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及TNM分期的升高，其表達也隨之增加。

癌，非小細胞肺；原癌基因蛋白質(zhì)c-Pim-1；靶向治療

隨著全球空氣污染日趨嚴(yán)重，易感人群增多，以呼吸道為媒介而導(dǎo)致的肺部疾病日趨增多，其中以肺癌的發(fā)病率上升為主要體現(xiàn)。世界衛(wèi)生組織2003年公布的資料顯示，肺癌患者逐年增加，無論是發(fā)病率還是病死率來看，肺癌毫無疑問成為全球最常見、最主要的惡性腫瘤之一。原癌基因Pim-1是Pim基因家族(目前發(fā)現(xiàn)的有Pim-1、Pim-2和Pim-3)中的一員，其過表達能夠抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、影響基因組穩(wěn)定性。國內(nèi)外已有多項研究證實Pim-1基因的表達上調(diào)與諸多實體瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[1-4]，而在非小細胞性中的表達及其可能發(fā)揮的作用在國內(nèi)外鮮有研究，研究已證實c-Myc蛋白在肺癌組織中過度表達，并與其惡變程度呈正相關(guān)[5]。鑒于對c-Myc基因目前研究相對更成熟，作用機制以及影響因素等方面探究得也相對明朗，本研究運用RT-PCR、qRT-PCR及免疫組織化學(xué)方法從基因及蛋白兩個水平上檢測Pim-1在非小細胞肺癌組織中的表達，并進一步分析目的基因與肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系；再結(jié)合c-Myc這種目前研究較成熟的基因，通過分析兩種原癌基因之間的相關(guān)性來初步探討Pim-1在非小細胞肺癌發(fā)病機制中的作用及其與c-Myc表達的關(guān)系，為臨床上早期診斷肺癌、評估預(yù)后及基因治療方面，奠定實驗基礎(chǔ)、提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2011年1月至2012年1月在本院胸外科行手術(shù)切除的非小細胞肺癌患者30例，收集病灶及癌旁正常肺組織(距離腫瘤邊緣大于5 cm)標(biāo)本，確?；颊咝g(shù)前均未接受手術(shù)、放化療及生物靶向治療，且所有入選標(biāo)本均經(jīng)本院病理科醫(yī)生術(shù)后病理證實為非小細胞肺癌。所收集的標(biāo)本臨床病理特征，均由后期在病案室查看病歷資料及病理科查看術(shù)后組織病理報告收集獲取。

1.2 試劑 總RNA提取試劑Trans Zol試劑盒、重組核糖核酸酶抑制劑、M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒及PCR擴增試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；qRT-PCR染料購自TaKaRa公司；引物由Invitrogen公司合成。Pim-1、c-Myc一抗抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品；Two-Step IHC Detection Reagent購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法 RT-PCR及qRT-PCR均嚴(yán)格按照試劑盒逐步操作，設(shè)計合成的Pim-1引物：F：5′-GAG GTT GGG ATG CTC TTG TC-3′；R：5′-GCG GAT GCC TGA GTA GAC C-3′。用OD×mm(Pim-1)/OD×mm(GAPDH) 這一計算公式計算出目的基因 Pim-1 mRNA的相對表達量；qRT-PCR檢測以GAPDH作為內(nèi)參對照，以2-△△Ct表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)，實驗重復(fù)3次。免疫組織化學(xué)采用非生物素二步法，一抗?jié)舛葹?∶200，采用DAB顯色，陽性染色如下：細胞核和(或)細胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色至黃棕色或棕褐色。評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[6]中的方法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Pim-1 mRNA表達水平 在非小細胞肺癌組織中Pim-1 mRNA表達量明顯高于癌旁正常組織，30例肺癌組織標(biāo)本中Pim-1 mRNA表達陽性(圖1)21例，相應(yīng)癌旁組織陽性7例，陽性表達率分別為70.0%和23.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.125、P=0.000)；同時Pim-1 mRNA相對表達量(OD值檢測)在非小細胞肺癌組織中(0.798±0.083)也顯著高于癌旁正常組織(0.394±0.107)，其差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.521、P<0.01)。單因素方差分析的結(jié)果表明，非小細胞性肺癌中Pim-1基因的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.16，P<0.01)，Durmett-t檢驗顯示Pim-1基因在非小細胞肺癌中的表達水平(7.648±1.231)與癌旁組織(12.141±1.871)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，免疫組化的結(jié)果顯示(圖2)：在30例非小細胞肺癌組織中Pim-1蛋白陽性表達18例，陽性率為60%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.000、P=0.002)。

1：DNA Marker；2：陰性對照；3～5：肺癌組織；6～8：癌旁組織；9：空白。

圖1 RT-PCR檢測Pim-1 mRNA表達水平

2.2 Pim-1的表達與臨床病理特征的關(guān)系 采用Fisher確切概率法進行分析Pim-1表達與各病理特征間關(guān)系(表1)，肺癌中Pim-1的表達與患者年齡、性別、吸煙史、病理分化程度及類型等沒有明顯的聯(lián)系(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期關(guān)系密切，呈正相關(guān)(P<0.05)。

A:肺癌組織;B:癌旁組織。

圖2 Pim-1的表達(×200)

表1 Pim-1的表達與臨床病理特征的關(guān)系

A：肺癌組織；B：癌旁組織。

圖3 兩組標(biāo)本中c-Myc的陽性表達(×200)

2.3 非小細胞性肺癌組織中Pim-1及c-Myc蛋白表達的呈正相關(guān) 30例標(biāo)本中c-Myc陽性表達(圖3)20例，陽性率為66.7%，癌旁組織陽性表達11例，陽性率為30.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.076、P=0.04)。結(jié)果證實Pim-1及c-Myc在非小細胞肺癌組織中存在表達，二者共同表達陽性例數(shù)為15例，共同表達陰性例數(shù)為7例，采用Spearman等級分析進行相關(guān)性分析，r=0.433，P<0.05，具有正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

3.1 Pim-1與非小細胞肺癌 Pim-1蛋白隸屬于絲氨酸/蘇氨酸家族3個成員之一，具有高保真性及自身組成性激活突變型[7-9]，可編碼2種不同的Pim-1蛋白產(chǎn)物，在3′-非編碼區(qū)域存在活性因子聚集，可以導(dǎo)致終止密碼子的嵌入，引起復(fù)制過程中的A/U富集平衡破壞，使得原本較低水平的Pim-1表達上調(diào)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，Pim-1的磷酸化在細胞分型、分化和細胞凋亡中起著重要作用，在抑制細胞凋亡和促進細胞增殖中也起著重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA及蛋白水平非小細胞肺癌中癌組織Pim-1表達水平均明顯高于癌旁正常組織，相關(guān)臨床病理特征顯示Pim-1蛋白表達量與患者的年齡、性別、吸煙史、腫瘤病理類型及分化程度等臨床特征無關(guān)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期關(guān)系密切，且呈正相關(guān)關(guān)系，因此作者推測Pim-1很可能在很大程度上參與了非小細胞肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，為臨床預(yù)測預(yù)后提供理論依據(jù)。

3.2 Pim-1與c-Myc的協(xié)同作用 Pim-1與c-Myc強大的聯(lián)合作用效應(yīng)最早是在淋巴瘤形成的研究中發(fā)現(xiàn)的，隨后發(fā)現(xiàn)Pim-1在人類前列腺癌組織中具有高表達，并且其高表達能加強在人類前列腺腫瘤細胞株中致癌效應(yīng)[13]，研究發(fā)現(xiàn)Pim-1與c-Myc共同作用參與前列腺癌的產(chǎn)生和進展，其中可能的作用機制是Pim-1基因增強c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，進而參與細胞增殖的調(diào)控。雖然Pim-1與c-Myc表達發(fā)揮致癌效應(yīng)的分子學(xué)機制目前尚未明確，但可以明確c-Myc磷酸化作用可以延長Pim-1半衰期[14]。此外，Pim-1的高表達可以通過作為c-Myc基因的輔因子進而加強c-Myc的復(fù)制轉(zhuǎn)錄活性。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測了在30例非小細胞肺癌中Pim-1與c-Myc的蛋白表達量。結(jié)果顯示，c-Myc蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達量顯著高于癌旁正常組織，且2個基因存在正相關(guān)作用，在30例非小細胞肺癌組織中，18例Pim-1表達陽性，20例c-Myc表達陽性，其中15例二者均表達陽性，7例均表達陰性。因此作者推測二者在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)系密切，且相互促進，并進一步證實了Pim-1可能在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

3.3 Pim-1可能成為非小細胞肺癌診治的新靶點 Pim-1在越來越多的腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)，如胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等，表明Pim-1在各種不同類型腫瘤中的表達相對穩(wěn)定，敏感性較高，在某種情況下，腫瘤中檢測到Pim-1的表達往往提示預(yù)后不良[14]。近年來Pim-1的高表達影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機制逐漸成為了研究熱點。體外實驗證實Pim-1過表達可以加強腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并能阻止藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡能力[2-3]。本研究發(fā)現(xiàn)Pim-1在非小細胞肺癌中的表達量明顯高于非癌變的正常組織，與前人研究結(jié)果一致。說明Pim-1基因作為特異性的腫瘤標(biāo)記物是可行的，因此，作者推測在非小細胞肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷中，Pim-1也是一個潛在的、重要的、有效的腫瘤標(biāo)記物。并且針對該基因的小分子化學(xué)藥物抑制劑，抑或相關(guān)的單克隆抗體等也能成為除放化療治療方案以外重要的二、三線靶向治療途徑，這可以為喪失了手術(shù)切除治療機會的晚期肺癌患者帶來福音。

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The expression of Pim-1 in non-small cell lung cancer and its relationship with c-Myc

LiuXinghong,WenGuilan△

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To investigate the expression of Pim-1 in non small cell lung cancer and adjacent normal tissues,and study the relationship between c-Myc and Pim-1 in the corresponding tissue gene expression.Methods Totally 30 cases of non small cell lung cancer tissue and adjacent normal lung tissues were collected by surgical operation in department of thoracic surgery.Clinical data were statisticed and tracking late pathologic results,using RT-PCR,qRT-PCR and immunohistochemical method to detect Pim-1 mRNA,c-Myc and Pim-1 protein expression in lung cancer and adjacent normal tissue,and to analyze the relationship between the expression of Pim-1 and c-Myc.Results The positive rate of Pim-1 mRNA and protein expression in non small cell lung cancer was obviously higher than that in adjacent normal tissue,the mRNA expression levels were 0.798±0.083 and 0.394±0.107 (P<0.01),the protein positive cases were 18 cases and 6 cases (P=0.002).The expression of Pim-1 protein had no relationship on age,gender,smoking history,pathological types and degree of differentiation of patients with non-small cell lung cancer (P>0.05),bue had related to ymph node metastasis and TNM stages of tumor (P<0.05),with lymph node metastasis and TNM stages increases,its expression quantity also rise.There was a positive correlation between Pim-1 and c-Myc protein expression,correlation coefficient (r) was 0.433 (P=0.017).Conclusion High expression of Pim-1 in non small cell lung cancer gene and is also increased with lymph node metastasis and TNM stages,Pim-1 and c-Myc expression has positive correlation,this could provide clues to the early diagnosis and prognosis evaluation of non small cell lung cancer,and also provides a new train of thought and to find a new target for gene therapy of lung cancer.

carinoma,non-small-cell lung;pro-oncogene proteins c-pim-1; targeted therapy

劉星宏(1988-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事非小細胞性肺癌的診療、呼吸系統(tǒng)感染方面的研究。

△通訊作者，E-mail:13707089818@163.com。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.005

A

1671-8348(2015)15-2031-03

2014-11-08

2015-02-16)