神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響

張 偉,劉翠蕓,劉佩佩,付文娟,孫水林△,席文娜

(1.南昌大學(xué)附屬感染病醫(yī)院肝病科,南昌 330000;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染性疾病科,南昌 330006)

論著·基礎(chǔ)研究

神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響

張 偉1,劉翠蕓2,劉佩佩2,付文娟2,孫水林2△,席文娜2

(1.南昌大學(xué)附屬感染病醫(yī)院肝病科,南昌 330000;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染性疾病科,南昌 330006)

目的 觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響。方法將30只雌性昆明小鼠分成3組：纖維化模型組(A組)、NGF干預(yù)組(B組)和生理鹽水對(duì)照組(C組)。8周時(shí)采集標(biāo)本，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、清蛋白(ALB)；放射免疫法檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)：透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)。采用Ishaki評(píng)分系統(tǒng)對(duì)小鼠肝組織炎癥活動(dòng)度及纖維化程度進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果A、B組ALT、AST、HA、LN均明顯高于C組(F=111.45,658.80,157.43,167.99;P<0.05);B組ALT、AST、LN均明顯低于A組(P<0.05)。HE染色、網(wǎng)狀纖維染色及Masson染色顯示，A組肝組織炎癥及纖維化程度最明顯，B組肝組織炎癥較A組顯著減輕，未形成纖維間隔，纖維組織細(xì)短，C組肝組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維形成。A組肝臟炎癥分級(jí)和纖維化分期評(píng)分較B、C組高，且3組炎癥活動(dòng)度得分、纖維化得分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論NGF可以阻斷CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，減輕肝組織炎癥。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子；四氯化碳；肝纖維化

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族中的一員，NGF家族由一類結(jié)構(gòu)和功能同源的蛋白組成[1]，廣泛分布于人體內(nèi)。早在1951年，Levi-Montalcin等[2]發(fā)現(xiàn)它與反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞表面受體結(jié)合，在神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、功能維持中起著重要的作用。后來，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)NGF可作用于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)功能，還參與炎性腸病、銀屑病等多種炎性疾病的發(fā)生[3]。進(jìn)一步研究表明NGF還可以作為一種重要的組織修復(fù)因子[4]，而肝纖維化正是肝臟慢性炎癥長(zhǎng)期反復(fù)修復(fù)而引起的病理結(jié)果，故有學(xué)者推測(cè)NGF與肝纖維化之間存在某種內(nèi)在聯(lián)系。近年來，有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NGF可誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)凋亡，從而影響肝纖維化的進(jìn)展[5]。但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果如何罕見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過建立動(dòng)物肝纖維化模型，觀察NGF對(duì)四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)6～8 周齡健康雌性昆明小鼠30只，體質(zhì)量(20±2)g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(贛)2011-0001。

1.2 儀器與試劑 透明質(zhì)酸放射免疫試劑盒、Ⅳ型膠原放射免疫試劑盒和碘(125I)Ⅲ型前膠原氨端肽放射免疫試劑盒均由北京生方生物技術(shù)研究所提供；蘇木精：進(jìn)口分裝；伊紅：上海銳聰科技發(fā)展有限公司；超高倍顯微分析系統(tǒng)：泰豪科技股份有限公司。NGF由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉立生教授惠贈(zèng)。

1.3 方法 將30只小鼠平均分成3組，即A組：3 mL/kg皮下注射40%CCL4(用橄欖油稀釋)，每隔2天1次，同時(shí)每日肌內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL，共8周；B組：3 mL/kg皮下注射40%CCL4(用橄欖油稀釋)，每隔2天1次，同時(shí)每日肌內(nèi)注射NGF 0.1 mL(即30 μg)，共8周；C組：以等量生理鹽水皮下注射，每隔2天1次，共8周。在實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，小鼠處死前12 h禁食、禁飲。實(shí)驗(yàn)步驟：乙醚麻醉后，摘眼球采血，分離血清標(biāo)本用于生化及核醫(yī)學(xué)檢測(cè)；再取出右葉肝組織，用10%甲醛固定，石蠟切片用于檢測(cè)。(1)HE染色：經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片處理后制成4 μm連續(xù)切片6張，切片面積約1 cm×1 cm，常規(guī)HE染色。(2)特殊染色：網(wǎng)狀纖維染色、masson染色。(3)Ishaki評(píng)分系統(tǒng)[6-7]主要觀察指標(biāo)：①血液生化指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、清蛋白(ALB)；②肝纖維化指標(biāo)包括透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)；③肝臟組織大體標(biāo)本、病理形態(tài)、Ishaki評(píng)分來觀察比較各組肝組織炎癥活動(dòng)度及纖維化程度。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠肝功能指標(biāo)比較 3組小鼠實(shí)驗(yàn)8周時(shí)血液標(biāo)本檢測(cè)，肝功能指標(biāo)比較，見表1。

2.2 3組小鼠肝纖維化指標(biāo)比較 3組小鼠實(shí)驗(yàn)8周時(shí)血清標(biāo)本檢測(cè)，肝纖維化指標(biāo)變化比較，見表2。

2.3 3組小鼠肝組織大體肉眼觀察結(jié)果 A組肝臟顏色較蒼白，包膜粗糙，可見細(xì)小顆粒，質(zhì)地較硬；B組肝臟體積增大，外觀較A組色澤鮮艷，包膜更光滑、飽滿，未見顆粒，質(zhì)軟更軟，出血較少；C組肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤(rùn)，包膜光整，質(zhì)地柔軟，見圖1。

表1 3組小鼠8周時(shí)肝功能指標(biāo)比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較。

表2 3組小鼠8周時(shí)肝纖維化指標(biāo)比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；-：未測(cè)出實(shí)際數(shù)值。

2.4 光學(xué)顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 肝組織病理表現(xiàn) A組肝臟炎癥及纖維化程度最明顯，表現(xiàn)為肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，廣泛脂肪變性，氣球樣變、炎癥壞死及彌漫的纖維間隔形成，匯管區(qū)可見網(wǎng)狀纖維粗而多，膠原纖維亦粗，且交織成網(wǎng)狀；B組肝細(xì)胞纖維化程度較A組顯著減輕，匯管區(qū)見網(wǎng)狀纖維細(xì)少，膠原纖維也很細(xì)短，呈分支狀，未形成纖維間隔，且肝細(xì)胞氣球樣變、脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較A組輕；C組肝細(xì)胞排列整齊，肝竇、肝索清晰，未見明顯的纖維形成，見圖2～4。

A：A組；B：B組；C：C組。

圖1 3組小鼠8周時(shí)肝組織大體形態(tài)

A：A組；B：B組；C：C組。

圖2 3組小鼠8周時(shí)肝組織HE染色(×100)

A：A組；B：B組；C：C組。

圖3 3組小鼠8周時(shí)肝纖維化網(wǎng)狀纖維染色(×100)

A：A組；B：B組；C：C組。

圖4 3組小鼠8周時(shí)肝纖維化masson染色(×100)

2.4.2 肝臟炎癥活動(dòng)度及纖維化Ishaki評(píng)分 3組間肝臟炎癥活動(dòng)度得分及肝纖維化得分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HC=12.09，P<0.01;HC=17.95，P<0.01)，見圖5、6。

圖5 肝臟炎癥活動(dòng)度評(píng)分

圖6 肝纖維化評(píng)分

3 討 論

各種原因(如病毒性、藥物性、酒精性、自身免疫性、代謝性等)引起的肝臟慢性損傷和修復(fù)，會(huì)使纖維結(jié)締組織增生，逐漸形成肝纖維化[8]。然而，肝纖維化可進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌，直接威脅到肝病患者的生命。如能阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化，就可減少嚴(yán)重后果的發(fā)生，這是肝病治療的關(guān)鍵，也是目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

NGF作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)的中的應(yīng)用已經(jīng)很成熟了。近年來，NGF在肝臟疾病中的作用亦展露頭角。一方面，肝損傷時(shí)肝細(xì)胞可表達(dá)NGF，而NGF可抑制核因子-κB的激活，減少促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制肝臟炎性反應(yīng)，減緩肝纖維化的進(jìn)展[9]。另一方面，NGF與肝纖維化密切相關(guān)，特別是對(duì)肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，即HSC的活化及增殖，其在肝纖維化中扮演重要的角色。NGF可抑制HSC的增殖，作用機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)凋亡來調(diào)節(jié)HSC的數(shù)量[10]。另外，NGF可抑制HSC合成Ⅰ、Ⅲ型膠原，誘導(dǎo)HSC凋亡，抑制HSC膠原分泌，可能是NGF抗肝纖維化的作用機(jī)制[11]。學(xué)者們通過體外實(shí)驗(yàn)逐漸認(rèn)識(shí)到NGF在抗肝纖維化中的作用，為此本課題就NGF與抗肝纖維化作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行了深入研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)8周后，ALT、AST在纖維化模型組(A組)、NGF干預(yù)組(B組)和生理鹽水組(C組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但3組中TBIL、ALB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ALT、AST為反映肝臟炎癥的敏感指標(biāo)，ALT存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，AST通常存在于線粒體中，A、B組中AST/ALT>1，本研究結(jié)果提示3組肝細(xì)胞均有損傷，呈慢性化表現(xiàn)。ALT、AST在A組水平最高，在B、C組依次降低，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明NGF能有效降低ALT、AST水平，可改善肝臟的炎癥。其中TBIL、ALB在A、B、C 3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TBIL及ALB不能敏感地反映CCL4誘導(dǎo)的小鼠早期肝損傷,可能在肝臟病變和病程達(dá)到一定程度后才會(huì)有變化。從肝組織病理常規(guī)HE染色觀察到，A組匯管區(qū)廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變均較B、C組嚴(yán)重；另外Ishaki肝臟炎癥評(píng)分顯示，A組小鼠得分多為10～14分，B組多為7～9分，C組多為0～3分，且3組肝臟炎癥活動(dòng)度得分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HC=12.09,P<0.01)。以上結(jié)果進(jìn)一步提示NGF有減輕CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥的作用，也有利于減緩肝纖維化的進(jìn)展。

肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PⅢ在A組中顯著升高，高于B、C組，各實(shí)驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中B組HA、LN、PCⅢ水平較A組明顯低，提示NGF有延緩或逆轉(zhuǎn)CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成的作用。NGF能有效阻斷肝纖維化亦在組織病理形態(tài)學(xué)中得到證實(shí)：A組masson染色和網(wǎng)狀纖維染色可見匯管區(qū)周圍纖維化明顯，可見大量粗且長(zhǎng)的網(wǎng)狀纖維、膠原纖維以及纖維間隔形成；B組masson染色和網(wǎng)狀纖維染色顯示其纖維化程度較A組顯著減輕，纖維組織細(xì)少；C組僅可見到稀少的細(xì)短成毛刺狀纖維。Ishaki肝纖維化評(píng)分顯示，A組小鼠得分均較高，多數(shù)在5分，B組小鼠得分多為3分，C組小鼠則多為0分，3組肝纖維化得分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HC=17.95,P<0.01)。以上結(jié)果表明NGF可有效阻斷CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，減輕肝組織炎癥。

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《重慶醫(yī)學(xué)》雜志對(duì)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的有關(guān)要求

1.統(tǒng)計(jì)學(xué)符號(hào)：按GB 3358-1982《統(tǒng)計(jì)學(xué)名詞及符號(hào)》的有關(guān)規(guī)定，統(tǒng)計(jì)學(xué)符號(hào)一律采用斜體。

2.研究設(shè)計(jì)：應(yīng)告知研究設(shè)計(jì)的名稱和主要方法。如調(diào)查設(shè)計(jì)(分為前瞻性、回顧性或是橫斷面調(diào)查研究)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(應(yīng)告知具體的設(shè)計(jì)類型，如自身配對(duì)設(shè)計(jì)、成組設(shè)計(jì)、交叉設(shè)計(jì)、析因設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)等)，臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)(應(yīng)告知屬于第幾期臨床試驗(yàn)，采用了何種盲法措施等)；主要做法應(yīng)圍繞4個(gè)基本原則(重復(fù)、隨機(jī)、對(duì)照、均衡)概要說明，尤其要告知如何控制重要非試驗(yàn)因素的干擾和影響。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法的選擇：對(duì)于定量資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)`計(jì)類型、資料所具備的條件和分析目的，選用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；對(duì)于定性資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計(jì)類型、定性變量的性質(zhì)和頻數(shù)所具備的條件及分析目的，選用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于回歸分析，應(yīng)結(jié)合專業(yè)知識(shí)和散點(diǎn)圖，選用合適的回歸類型，不應(yīng)盲目套用簡(jiǎn)單直線回歸分析；對(duì)于具有重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢驗(yàn)回歸分析資料，不應(yīng)簡(jiǎn)單化處理；對(duì)于多因素、多指標(biāo)資料，要在一元分析的基礎(chǔ)上，盡可能運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，以便對(duì)因素之間的交互作用和多指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系做出全面、合理的解釋和評(píng)價(jià)。

5.統(tǒng)計(jì)結(jié)果的解釋和表達(dá)：應(yīng)寫明采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的具體名稱(如：成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)、兩因素析因設(shè)計(jì)資料的方差分析、多個(gè)均數(shù)之間兩兩比較的q檢驗(yàn)等)，統(tǒng)計(jì)量的具體質(zhì)(如：t=3.45，χ2=4.68，F(xiàn)=6.79等)；在用不等式表示P值的情況下，一般情況下選用P>0.05、P<0.05和P<0.01三種表達(dá)方式，無須再細(xì)分為P<0.001或P<0.000 1。當(dāng)涉及總體參數(shù)(如總體均數(shù)、總體率)時(shí)，再給出顯著性檢驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)，應(yīng)再給出95%可信區(qū)間(CI)。

Effect of nerve growth factor on CCL4-induced hepatic fibrosis in mice*

ZhangWei1,LiuCuiyun2,LiuPeipei2,FuWenjuan2,SunShuilin2△,XiWenna2

(1.DepartmentofLiverDisease,AffiliatedInfectiousDiseasesHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330000,China；2.DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To observe the effect of nerve growth factor(NGF) on CCL4-induced hepatic fibrosis in mice.Methods The hepatic fibrosis model was induced by subcutaneous injection of CCL4in mice.Thirty female Kunming mice were equally and randomly divided into three groups:fibrosis model group (A),NGF intervention group (B) and normal saline control group (C).At 8 weeks following the initiation of experiment,the samples were collected to measure ALT,AST,TBIL,ALB by the fully automativ biochemical analyzer,an the liver fibrosis indices (HA,LN,PCⅢ) by radioimmunoassay.The Ishaki scoring system was adopted to assess the severity of hepatic inflammation and fibrosis degree.Results Serum levels of ALT,AST,HA and LN in the group A and B were significantly higher than those in the group C (F=111.45,658.80,157.43,167.99;P<0.05),the levels of ALT、AST and LN in the group B were significantly lower than those in the group A (P<0.05).The HE staining,reticular fiber staining and Masson staining showed that the liver fibrosis degree and the liver tissue inflammation in the group A were most obvious,the liver tissue inflamation in the group B were significantly alleviated as compared with the group A.No fibrous septum was formed and the fiber tissues were fine and short.No obvious inflammatory cells infiltration and fibers formation were found in the liver tissue of the group C.The scores of liver inflamation grade and fibrosis staging in the group C were higher than those in the group B and C,moreover the scores of liver inflammation grade and fibsosis had statstical differences among 3 groups (P<0.05).Conclusion NGF can block hepatic fibrosis induced by CCL4and relieve the liver inflammation.

nerve growth factor;CCL4;hepatic fibrosis

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.003

江西省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目(20071077)。

張偉(1985-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事乙型肝炎的抗病毒治療及肝纖維化治療方面的研究。

△通訊作者，E-mail:sunshuilin2280@126.com。

R575.2

A

1671-8348(2015)15-2024-04

2014-11-10

2015-02-07)