慢性髓系白血病中l(wèi)et-7a-3甲基化態(tài)勢(shì)及其臨床意義

吳得紅，姚冬明，李 云，林 江，鄧兆群，楊 靜，陳星星，錢 震，馬吉春，錢 軍△

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212002；4.江蘇省昆山市第三人民醫(yī)院血液科 215300)

·論 著·

慢性髓系白血病中l(wèi)et-7a-3甲基化態(tài)勢(shì)及其臨床意義

吳得紅1,4，姚冬明2，李 云1，林 江3，鄧兆群3，楊 靜1，陳星星1，錢 震1，馬吉春3，錢 軍1△

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212002；4.江蘇省昆山市第三人民醫(yī)院血液科 215300)

目的 探討慢性髓系白血病(CML)患者中l(wèi)et-7a-3啟動(dòng)子的甲基化態(tài)勢(shì)及其臨床意義。方法建立實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR (RQ-MSP)分別檢測(cè)25例對(duì)照者及52例CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中l(wèi)et-7a-3啟動(dòng)子未甲基化水平。結(jié)果52例CML患者未甲基化let-7a-3啟動(dòng)子(59.6%)為陽(yáng)性，而對(duì)照組僅1例(4%)陽(yáng)性，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ROC曲線分析表明，let-7a-3啟動(dòng)子未甲基化作為輔助診斷CML有較好的特異性。未甲基化let-7a-3啟動(dòng)子水平與BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄水平呈顯著正相關(guān)(r=0.641，P=0.001)，但與患者的白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)及血紅蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。在慢性期和加速期let-7a-3未甲基化水平顯著高于急變期。結(jié)論let-7a-3基因低甲基化水平隨疾病進(jìn)展而降低。

慢性髓系白血??；let-7a-3；低甲基化；微小RNA

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種發(fā)生在多能造血干細(xì)胞的慢性骨髓增殖性腫瘤，以外周血中大量不成熟粒細(xì)胞及脾腫大為主要臨床特征。在受累的細(xì)胞系中，可發(fā)現(xiàn)Ph染色體和(或)BCR/ABL融合基因。按病情進(jìn)展分為慢性期(CP)、加速期(AP)和急變期(BP/BC)。Ph染色體和(或)BCR-ABL融合基因是診斷CML的必要條件。然而CML的發(fā)生、發(fā)展也受其他多種因素的調(diào)節(jié)，如表觀遺傳學(xué)修飾等。先前有研究表明死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)[1]、降鈣素(CT)[2-3]等抑癌基因的高甲基化，本課題組曾報(bào)道過(guò)螺旋酶抗原(HAGE)低甲基化可能和CML的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)在CML的發(fā)病過(guò)程中與BCR/ABL融合基因一起也發(fā)揮著重要作用[5-7]。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，let-7對(duì)人類的腫瘤發(fā)揮抑癌基因效應(yīng)，其表達(dá)增加能夠抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是大部分研究沒(méi)有將其成員區(qū)分開來(lái)。let-7a-3作為一種非編碼miRNA近年來(lái)備受關(guān)注，它是let-7家族中的一員，對(duì)正常細(xì)胞的增殖、分化和凋亡發(fā)揮重要作用，而這種生物學(xué)效應(yīng)，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因表達(dá)的一種重要機(jī)制——甲基化修飾，也調(diào)控著let-7a-3的表達(dá)。有研究證實(shí)，let-7a-3在大部分人類正常組織中高度甲基化，而在肺腺癌中低甲基化[8]。對(duì)于let-7a-3在CML中的甲基化態(tài)勢(shì)及臨床意義目前尚不清楚。因此本研究旨在了解let-7a-3在CML中的甲基化狀況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 52例CML患者均來(lái)自江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院，其診斷和分期均參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[9]，且每例患者都檢測(cè)到Ph染色體和(或)BCR/ABL融合基因。其中男29例，女23例；年齡15～83歲，平均 (46.3±17.3)歲。包括40例初診慢性期、5例加速期、7例急變期患者。25例對(duì)照組均為健康供髓者。本研究得到每位患者的知情同意，并獲得江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 let-7a-3 RQ-MSP引物序列

1.2 方法

1.2.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNC)分離和基因組DNA制備 抽取患者及對(duì)照組骨髓液10 mL，經(jīng)過(guò)肝素抗凝，通過(guò)Ficoll液(上海試劑二廠)離心分離BMNC，根據(jù)基因組DNA試劑盒(美國(guó)Gentra公司產(chǎn)品)操作說(shuō)明，提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定光密度值確定DNA水平和純度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 對(duì)每例研究對(duì)象取1 μg DNA樣本，采用亞硫酸氫鈉修飾試劑盒(加拿大Chemicon公司)，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行基因組DNA修飾，修飾后的樣本DNA于-80 ℃保存，用于甲基化特異性PCR。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR(PCR，RQ-MSP) 應(yīng)用Methyl Primer Express v1.0軟件(美國(guó) ABI 公司)設(shè)計(jì)甲基化(M)和未甲基化(U)RQ-MSP引物，選擇ALU基因作為檢測(cè)let-7a-3未甲基化的內(nèi)參基因，見(jiàn)表1。18 μL RQ-MSP 反應(yīng)體系包含1×PCR緩沖液、MgCl24.0 mmol/L、引物0.4 μmol/L、1.0 U熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)以及20 ng 修飾過(guò)的樣本DNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min 預(yù)變性，然后 94 ℃變性 30 s、56 ℃(ALU為60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s，50個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后再72 ℃延伸 30 s，PCR熒光收集設(shè)為73 ℃ 30 s。熔解曲線程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列正確的M/U和ALU重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)模板DNA的去離子水作為空白對(duì)照。用30 g/L瓊脂糖凝膠80 V電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，1 h后在Gene Genius 凝膠成像儀上顯像并拍照。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序 將let-7a-3啟動(dòng)子M、U以及ALU陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)生工生物(上海)有限公司克隆測(cè)序，驗(yàn)證所得序列。

1.2.5 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 將采集的骨髓細(xì)胞采用24 h短期培養(yǎng)法制備染色體標(biāo)本，然后進(jìn)行R顯帶處理。按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)》進(jìn)行核型分析。

1.2.6 分析方法 計(jì)算未甲基化的let-7a-3啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)化比率，依據(jù)公式：

Nunmethylation-let-7a-3= (Eunmethylation-let-7a-3)ΔCT unmethylation-let-7a-3 (control-sample)÷ (EALU)ΔCT ALU(control-sample)

(1)

E=10(-1 /slope)

(2)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)分析對(duì)照組和CML組之間let-7a-3啟動(dòng)子未甲基化水平的差異，分析let-7a-3未甲基化水平在不同性別、CML不同分期、不同核型之間的差異；用 Pearsons卡方檢驗(yàn)或者Fishers 確切概率法分析不同組間let-7a-3未甲基化陽(yáng)性/陰性概率差異；采用 Spearman 秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。通過(guò)ROC曲線和曲線下面積(AUC)分析let-7a-3未甲基化水平對(duì)CML的診斷價(jià)值。所有分析設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.2 let-7a-3未甲基化對(duì)CML的診斷價(jià)值 為了進(jìn)一步驗(yàn)證let-7a-3未甲基化水平能否作為CML診斷的一個(gè)指標(biāo)，本研究進(jìn)行了ROC曲線分析(圖3)，結(jié)果顯示，CML患者的AUC為0.749(95%CI：0.644～0.855)，以未甲基化水平為2.68%，診斷CML的靈敏度和特異性分別為58.5%和96.0%，雖靈敏度不好，但特異性較強(qiáng)。

A：未甲基化；B：甲基化；C：ALU。1：100 bp DNA Ladder；2：1例對(duì)照組標(biāo)本；3～11：CML標(biāo)本；12：陽(yáng)性對(duì)照；13：空白對(duì)照。

圖1 let-7a-3的MSP產(chǎn)物電泳結(jié)果

A：let-7a-3啟動(dòng)子甲基化產(chǎn)物測(cè)序圖，CpG中的CG未被硫化改變，仍為CG；B：let-7a-3未甲基化產(chǎn)物測(cè)序圖，CG中的C均被硫化改變?yōu)門，即為TG。

圖2 let-7a-3基因MSP產(chǎn)物測(cè)序圖

2.3 CML患者let-7a-3未甲基化與分期的關(guān)系 let-7a-3未甲基化頻率在不同性別、異常核型之間無(wú)明顯差異，但在CML不同分期之間存在組間差異(P=0.044)，見(jiàn)表2。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，慢性期和加速期患者未甲基化水平分別明顯高于急變期(P=0.012、0.041)，而急變期與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 CML患者ROC曲線

a:P<0.05,與急變期比較；b:P>0.05，與對(duì)照組比較。

圖4 對(duì)照組與CML患者let-7a-3未甲基化水平比較

2.4 let-7a-3未甲基化與CML臨床參數(shù)的相關(guān)性 let-7a-3未甲基化水平與患者的年齡、BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄水平之間相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.233(P=0.052)、0.641(P=0.001)，揭示主要在慢性期let-7a-3未甲基化水平與BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄水平呈顯著正相關(guān)。低甲基化陽(yáng)性組中BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄水平明顯高于陰性組(P=0.007)，見(jiàn)表 2。let-7a-3未甲基化水平與患者的白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)以及血紅蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 CML患者let-7a-3未甲基化與臨床參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表2 CML患者let-7a-3未甲基化與臨床參數(shù)的關(guān)系

*：中位數(shù)(范圍)。

3 討 論

miRNA是一種僅包含19～25個(gè)核苷酸序列的非編碼蛋白質(zhì)RNA，其作用是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[10]。已知一種miRNA最多能調(diào)控大約200種靶基因的功能。對(duì)正常細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，miRNA發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，如果miRNA的表達(dá)失調(diào)，將可能導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)許多疾病的發(fā)生[11-12]。

miRNA let-7a-3屬于let-7家族成員之一，目前對(duì)其在腫瘤形成中的作用還存在著爭(zhēng)議。多數(shù)研究認(rèn)為let-7通過(guò)抑制癌基因的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用，例如對(duì)RAS信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[13]，以及下調(diào)c-MYC蛋白表達(dá)等[14]。然而Brueckner等[8]發(fā)現(xiàn)在健康人類胎盤、大腦、骨髓、結(jié)腸、皮膚以及肺組織中l(wèi)et-7a-3呈高度甲基化狀態(tài)，而肺腺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7a-3呈低甲基化改變，肺腺癌細(xì)胞系經(jīng)去甲基化藥物處理后let-7a-3發(fā)生去甲基化而表達(dá)上調(diào)，且let-7a-3過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞集落形成。Lu等[15]發(fā)現(xiàn)，在卵巢上皮細(xì)胞癌中，let-7a-3低甲基化患者預(yù)后較高甲基化患者差，從而揭示let-7a-3可能有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的功能，并且這種功能部分是通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。因此從另一方面揭示了let-7a-3的致癌特性。對(duì)于let-7a-3在髓系白血病中的作用，本實(shí)驗(yàn)組曾經(jīng)報(bào)道過(guò)，獲得緩解的AML患者中，高表達(dá)的let-7a-3患者總體生存率(OS)以及無(wú)復(fù)發(fā)生存率(RFS)明顯低于低表達(dá)的let-7a-3患者[16]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CML患者BMNC中，let-7a-3啟動(dòng)子也處于顯著低甲基化狀態(tài)，這與Brueckner等[8]在肺腺癌中的研究結(jié)果相一致，而且let-7a-3低甲基化水平與BCR/ABL轉(zhuǎn)錄水平呈顯著正相關(guān)。因此在CML中l(wèi)et-7a-3低甲基化水平是伴隨BCR/ABL融合基因轉(zhuǎn)錄水平增加的分子事件。眾所周知，BCR/ABL融合基因是診斷CML的重要依據(jù)，其擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄水平有助于監(jiān)測(cè)病情以及判斷預(yù)后[17-18]。本研究通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，let-7a-3低甲基化改變對(duì)CML診斷的靈敏度和特異性分別為58.5%和96.0%，提示具有輔助診斷價(jià)值。但隨著CML疾病進(jìn)展let-7a-3低甲基化水平進(jìn)行性下降，與BCR/ABL轉(zhuǎn)錄本水平隨疾病進(jìn)展而增高相反，提示let-7a-3低甲基化改變是BCR/ABL融合基因致CML發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)早期事件，可能并不參與CML的疾病進(jìn)展過(guò)程，而let-7a-3過(guò)甲基化的白血病細(xì)胞經(jīng)過(guò)藥物選擇得以生存、克隆性擴(kuò)增并發(fā)生急性變。正如Du等[19]發(fā)現(xiàn)在胃腸腫瘤形成的早期過(guò)程中SOX17基因發(fā)生表達(dá)上調(diào)以保護(hù)性抑制腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，但在腫瘤形成的晚期階段則發(fā)生表達(dá)下調(diào)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。當(dāng)然，這還有待于將來(lái)的進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)let-7a-3低甲基化改變是CML慢性期的一個(gè)常見(jiàn)分子事件，可用于CML的分子輔助診斷，并且隨CML疾病進(jìn)展let-7a-3低甲基化水平進(jìn)行性下降。

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Methylation situation of let-7a-3 in chronic myeloid leukemia and its clinical significance*

WuDehong1,4,YaoDongming2,LiYun1，LinJiang3,DengZhaoqun3,YangJing1,ChenXingxing1,QianZhen1,MaJichun3,QianJun1△

(1.DepartmentofHematology,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;3.CentralLaboratory,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;4.DepartmentofHematology,theThirdPeople′sHospitalofKunshan,Jiangsu215300,China)

Objective To investigate the methylation situation of let-7a-3 promoter in patients with chronic myeloid leukemia (CML) and its clinical significance.Methods The methylation level of let-7a-3 promoter in the bone marrow mononuclear cells of 52 CML patients and 25 controls was detected by using the real-time quantitative methylation-specific PCR (RQ-PCR).Results The non-hypomethylation of let-7a-3 promoter was positive in 31 cases(59.6%) of 52 CML patients,while only 1 case(4%,1/25) in the control group,the difference between the two groups were statistically significant (P<0.01).The ROC curve analysis showed that the non-hypomethylation of let-7a-3 has better specificity for the auxiliary diagnosis of CML.The significantly positive correlation was found between the non-methylation level of let-7a-3 promoter and the BCR/ABL transcription level (r=0.641,P=0.001).In contrast,there was no obvious correlation between the non-methylation level of let-7a-3 promoter and the WBC count,platelet count and hemoglobin levels(P>0.05).The non-hypomethylation level of let-7a-3 in chronic phase and accelerate phase was significantly higher than that in blastic crisis of CML.Conclusion The hypomethylation level of let-7a-3 promoter is decreased with disease progression.

chronic myeloid leukemia;let-7a-3;hypomethylation;microRNA

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81270630、81172592、SH2013042)；鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SH2010015、SH2011056)；江蘇省“333工程”科研項(xiàng)目資助計(jì)劃(BRA2011085、BRA2013136)；江蘇省科技廳臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)資金項(xiàng)目(BL2012056)；鎮(zhèn)江市科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)項(xiàng)目(SS2012003)。

吳得紅(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事惡性血液病的臨床及基礎(chǔ)研究。

△通訊作者，E-mail：qianjun0007@sina.com。

R733.72

A

1671-8348(2015)15-2020-04

2014-10-18

2015-02-25)