免疫磁珠捕獲PCR快速檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

李婧姮，郭慧琴，高曉強(qiáng)，劉 芳，邱 實，李建武，曾海娟，劉 蘭，宋春美，劉 箐,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海慧耘生物科技有限公司，上海 200433；3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730020）

免疫磁珠捕獲PCR快速檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

李婧姮1，郭慧琴2，高曉強(qiáng)3，劉 芳3，邱 實1，李建武1，曾海娟1，劉 蘭2，宋春美1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海慧耘生物科技有限公司，上海 200433；3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730020）

利用免疫磁珠富集單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增進(jìn)行快速檢測。所制備的免疫磁珠選取在37 ℃條件下均勻振蕩1 h為最佳包被條件，1 mg磁珠偶聯(lián)抗體的最佳量為100 μg/mg，制備的免疫磁珠捕獲率為45%。所建立的免疫磁珠捕獲-PCR技術(shù)在樣品細(xì)菌濃度達(dá)到104CFU/mL即可被檢出，其靈敏度是直接PCR檢測限（105CFU/mL）的10 倍，可為病原菌的富集和快速檢測提供新方法。

免疫磁珠；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種常見的食源性致病菌，世界貿(mào)易組織于20世紀(jì)90年代將其列為四大食源性病原菌之一。由于其廣泛存在于自然界，當(dāng)牲畜感染后，最終可通過食物鏈導(dǎo)致人類感染。人類受感染后可導(dǎo)致腦膜炎、胃腸炎、敗血癥、孕婦流產(chǎn)等，新生兒及免疫力低下者更易感染。由于該菌能忍受冷凍和干燥，在極端的環(huán)境中亦能存活，因此對人體的身體健康造成潛在的危險[1-2]。

目前針對于Lm的檢測方法有傳統(tǒng)分離檢測法、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、酶免疫分析檢測技術(shù)等[3-4]。上述方法中，增菌培養(yǎng)是重要步驟但耗時長，ELISA方法由于單克隆抗體費(fèi)用昂貴，所以用ELISA盒進(jìn)行多種食品樣品的檢測費(fèi)用較高[5]。因此，建立一種快速的樣品前處理方法顯得尤為重要。免疫磁珠富集技術(shù)是以磁性微球通過結(jié)合特定抗體，加到待測樣品中與相應(yīng)抗原結(jié)合，再依靠磁場作用力使所需樣品在短時間內(nèi)得以大量濃縮的技術(shù)手段[6]。由于免疫磁珠富集技術(shù)具有快速及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分離及濃縮特定微生物、蛋白質(zhì)等微量有害物質(zhì)[7-10]。

本研究運(yùn)用免疫Lm的多克隆抗體與磁珠進(jìn)行偶聯(lián)制備免疫磁珠，探討磁珠與抗體最佳偶聯(lián)條件，結(jié)合免疫磁珠富集技術(shù)與選擇性平板培養(yǎng)法，初步建立免疫磁珠-選擇性平板快速檢測方案，對Lm進(jìn)行分離及鑒定，以實現(xiàn)對Lm進(jìn)行快速檢測[11]。同時，利用免疫磁珠富集技術(shù)進(jìn)行病原富集并聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，建立一種快速檢測Lm的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與儀器

Lm菌株（ATCC 43251） 上?；墼派锟萍加邢薰?。

羧基磁珠（直徑0.5 μm） 鄭州英諾生物科技有限公司；Lm多克隆抗體 上?；墼派锟萍加邢薰?；腦心浸液培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒、2-（N-嗎啉）乙磺酸（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid，MES）、碳二亞胺（carbodiimide，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、Taq DNA聚合酶及其他PCR試劑、本實驗所用引物根據(jù)文獻(xiàn)[12]報道，其核苷酸序列為：hly1：CGGAGGTTCCGCAAAAGATG；hly2：CCTCCAGAGTGATCGATGTT，試劑及引物合成均為生工生物工程（上海）股份有限公司。

P C R熱循環(huán)儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司；Mini-power電泳儀 美國伯樂公司；全系列離心機(jī)德國Eppendorf公司；磁分離架 鄭州英諾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羧基磁珠與抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

1.2.1.1 磁珠的活化

小瓶搖勻后移取200 μL羧基磁珠至1.5 mL離心管中，用200 μL的去離子水和MES（pH 6.0、0.05 mol/L）各洗2 次，然后用0.05 mol/L MES溶液配制100 mg/mL的EDC和NHS溶液，再分別加入100 μL EDC和NHS溶液到洗過的磁珠溶液中充分混合，并在室溫條件下振蕩45 min，振蕩結(jié)束，在磁力架上進(jìn)行磁分離5 min并除去清液，用200 μL 0.05 mol/L MES溶液洗2 次，分散在100 μL 0.05 mol/L MES溶液中，4 ℃保存[13-14]。

1.2.1.2 磁珠與抗體最佳偶聯(lián)溫度

取200 μL活化后的磁珠重懸于各離心管中，加入等量的用偶聯(lián)的緩沖液稀釋的500 μL抗體之后經(jīng)過[15]：1）4 ℃包被3 h；2）常溫條件下包被3 h；3）37 ℃包被3 h，每個溫度設(shè)定3 個平行。然后在磁力架上磁分離5 min后，吸取上清液于另一離心管中，用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒在595 nm波長處測得OD值，以確定磁珠與抗體最佳偶聯(lián)溫度[16]。

1.2.1.3 磁珠與抗體最佳偶聯(lián)時間

取200 μL活化后的磁珠重懸于各離心管中，分別加入等量的用偶聯(lián)的緩沖液稀釋的300 μL抗體，在37 ℃條件下分別偶聯(lián)0.5、1、2、3、4、6 h，保持磁珠處于均勻懸浮狀態(tài)，每個時間設(shè)定3 個平行。用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒測定OD值，以確定磁珠與抗體的最佳偶聯(lián)時間[17]。

1.2.1.4 羧基磁珠與抗體最佳偶聯(lián)率

取等量1 mg活化后的磁珠，分別加入40、60、80、100、200、400、600、800、1 000 μg的抗體，每組設(shè)定3 個平行。在37 ℃條件下包被1 h后，磁分離取上清溶液，用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒測定OD值，以確定磁珠與抗體最佳偶聯(lián)率[18]。

1.2.2 免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）的制備

取200 μL磁珠加入到300 μL抗體中，室溫條件下振蕩1 h，振蕩結(jié)束后磁分離5 min并去除上清液，并用含有2%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）室溫封閉1 h，封閉結(jié)束用PBS洗3 次，然后分散在200 mL PBS中，保存于4 ℃?zhèn)溆肹19]。

1.2.3IMBs捕獲率的確定

用接菌環(huán)挑去Lm單菌落接種于滅菌腦心浸液液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜。用無菌生理鹽水10 倍稀釋Lm菌液到104。取兩份樣品，均為100 μL，一份直接涂布于顯色培養(yǎng)基上，另一份加到1.5 mL離心管中，加入20 μL免疫磁珠，然后在37 ℃條件下孵育1 h，使免疫磁珠處于均勻混合的狀態(tài)。然后磁分離5 min，棄上清液后用PBS洗3 次，懸浮在20 μL PBS中，再涂布于顯色培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱培育20 h，觀察并統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)。

1.2.4 PCR檢測

取10 倍稀釋好的各濃度菌液100 μL，分別加入20 μL免疫磁珠，然后在37 ℃條件下孵育1 h，使免疫磁珠處于均勻混合的狀態(tài)[20]。然后磁分離5 min，吸走上清后用PBS洗3 次，重懸在20 μL PBS中，75 ℃裂解30 min后，Lm裂解后DNA會釋放出來，15 000 r/min離心15 min，使磁珠完全沉在PCR管底部，取上清液5 μL作模板[21-22]。將IMBs捕獲的細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測，PCR反應(yīng)體系為：含Mg2+的Buffer（10×）5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，正負(fù)引物（10 pmol/μL）3 μL，模板5 μL，用去離子水補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為變性95 ℃、20 min，95 ℃、30 s，退火55 ℃、45 s，延伸72 ℃、45 s，35 個循環(huán)，72 ℃、5 min，4 ℃保存[23]，并與直接PCR作比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧基磁珠與抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

2.1.1 偶聯(lián)溫度優(yōu)化

活化磁珠在不同溫度條件下與抗體偶聯(lián)，用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測得上清中剩余抗體的含量，3 次平行結(jié)果如表1所示。4 ℃時磁珠與抗體偶聯(lián)量為0.218 mg/mL，隨著溫度的升高，磁珠偶聯(lián)抗體的量也在不斷增加。常溫時磁珠與抗體偶聯(lián)量為0.387 mg/mL，37 ℃時磁珠偶聯(lián)抗體量為0.391 mg/mL，此時磁珠偶聯(lián)抗體量趨于飽和，故選擇37 ℃為最佳偶聯(lián)溫度。

表1 不同溫度條件下磁珠與抗體偶聯(lián)量Table 1 The concentrations of antibody conjugated to immunomagnetic beads at different temperatures mg/mL

2.1.2 偶聯(lián)時間優(yōu)化

活化磁珠與抗體在不同時間內(nèi)偶聯(lián)，用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測得上清中剩余抗體的OD值，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)偶聯(lián)時間在0.5～1 h，上清液的OD值快速遞減，磁珠和抗體大量偶聯(lián)，當(dāng)偶聯(lián)時間大于1 h，上清液的OD值趨于平緩，磁珠偶聯(lián)抗體已達(dá)到飽和。故選擇1 h為最佳偶聯(lián)時間。

圖1 時間對偶聯(lián)效果的影響Fig.1 Time course of conjugation between antibody and immunomagnetic beads

2.1.3 羧基磁珠與抗體偶聯(lián)率優(yōu)化

圖2 加入抗體量對偶聯(lián)效果的影響Fig.2 Effect of antibody concentration on the conjugation to immunemagnetic beads

用1 mg的活化磁珠與不同質(zhì)量的抗體在相同條件下偶聯(lián)，用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測得上清液中剩余抗體含量，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)加入抗體量在40～100 μg時，磁珠偶聯(lián)抗體的量隨加入抗體量的增加而增加，當(dāng)加入抗體量大于100 μg時，磁珠偶聯(lián)抗體的量趨于飽和，因此1 mg羧基磁珠偶聯(lián)抗體最佳用量為100 μg。

2.2 免疫磁珠捕獲率

根據(jù)平板計數(shù)，原Lm菌液濃度為2.2×108CFU/mL，IMBs與稀釋到104的Lm菌結(jié)合后，觀察其在顯色平板上的生長情況。如圖3所示，A平板是IMBs捕獲100 μL 104CFU /mL Lm菌在顯色平板上的生長情況，B平板是是100 μL 104CFU/mL Lm菌在顯色平板上的生長情況。圖3A顯色平板上紅色圓環(huán)圈住的藍(lán)綠色小點(diǎn)為Lm菌，中間連成片的棕色區(qū)域為免疫磁珠（顏色圖中未顯示），IMBs對Lm菌的捕獲率約為45%，說明IMBs對Lm菌體有良好的捕捉能力。

圖3 IMBs LLmm在顯色平板中的生長情況Fig.3 Growth status ofLmcaptured by IMBs in chromogenic medium

2.3 IMBs捕獲Lm-PCR檢測結(jié)果

圖4 IMBs-PCR和Direct-PCR捕菌效果比較Fig.4 Comparison of bacterial capture efficiency between IMBs-PCR and direct PCR

由圖4可知，6～9號泳道分別是濃度為108～105CFU/mL的Lm菌液做直接PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)條帶，直接PCR最低檢測限為105CFU/mL。1～5號泳道分別是濃度為104～108CFU/mL的Lm菌液用IMBs捕獲后再做PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)條帶，由此可知IMBs-PCR捕捉Lm最低檢測限可達(dá)到104CFU/mL，即所取的1 μL模板中只要有10 CFU Lm細(xì)菌就能被檢測出來，靈敏度是原來的10 倍，由此證明用IMBs富集Lm可有效提高PCR檢測的靈敏度。

3 結(jié) 論

本實驗證明了磁珠與抗體的偶聯(lián)時間和偶聯(lián)溫度均會對磁珠偶聯(lián)抗體的含量產(chǎn)生極大影響，在實驗中還發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)溫度過低不利于磁珠與抗體的結(jié)合，低溫條件下磁珠容易發(fā)生凝聚，抗體活性也比較低，在37 ℃時偶聯(lián)效果最好[18]。制備的免疫磁珠選取37 ℃條件下均勻振蕩1 h為最佳包被條件，1 mg磁珠偶聯(lián)抗體的最佳量為100 μg，制備出的IMBs捕獲率為45%。用IMBs富集Lm有效降低PCR對Lm的最低檢測限，樣品中只要有10 CFU /mL就能被檢測出來，整個檢測時間在7 h，與傳統(tǒng)檢測方法相比縮短了10～12 h[23-24]。

免疫磁珠雖廣泛，但仍存在一些問題，要想獲得大小均勻、粒度適中的磁珠，其制備難度較大[8]。目前市場上的磁珠價格也比較昂貴，大大限制了免疫磁珠的推廣及應(yīng)用。市場上由于單克隆抗體費(fèi)用昂貴，目前制備IMBs多使用多克隆抗體，但由于靶細(xì)胞表面有多個抗原決定簇，想要用IMBs分離到純的細(xì)胞也比較困難，用不同基團(tuán)的磁珠制備IMBs結(jié)合靶細(xì)胞雖可提高細(xì)胞分離率，但特異性受到影響[25]。隨著科技的發(fā)展，相信目前的問題都能解決，免疫磁珠將會得到更多的推廣和運(yùn)用。

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Immunomagnetic Capture PCR for Rapid Detection of Listeria monocytogenes

LI Jingheng1, GUO Huiqin2, GAO Xiaoqiang3, LIU Fang3, QIU Shi1, LI Jianwu1, ZENG Haijuan1, LIU Lan2, SONG Chunmei1, LIU Qing1,*
(1. College of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. Prajna Biology Technique Co. Ltd., Shanghai 200433, China; 3. Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730020, China)

This experiment was conducted using immunomagnetic enrichment followed by amplifi cation with polymerase chain reaction (PCR) for rapid detection of Listeria monocytogenes. The best coating conditions were achieved by shaking the prepared immunomagnetic beads at 37 ℃ for 1 h, and the amount of antibody conjugated to the immunomagnetic beads was 100 μg/mg, leading to a capture rate of 45%. The immunomagnetic capture PCR assay was able to detect as low as 104CFU/mL Listeria monocytogenes with 10 times higher sensitivity than direct PCR showing a limit of detection of 105CFU/mL. This PCR assay can provide a new method for the enrichment and rapid detection of pathogenic bacteria.

IMBs; Listeria monocytogenes; PCR

TS201.3

A

1002-6630（2015）12-0226-04

10.7506/spkx1002-6630-201512043

2014-10-15

上海理工大學(xué)大學(xué)生卓越工程項目；上海市科委重點(diǎn)支撐項目（13430502400）

李婧姮（1993—），女，本科生，研究方向為食品微生物。E-mail：jinghengl116@126.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機(jī)理及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn