氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合QuEChERS法快速篩查大米中多種農(nóng)藥殘留

邱偉芬，張昌娟，文 良，方 勇，胡秋輝

（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳518045）

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合QuEChERS法快速篩查大米中多種農(nóng)藥殘留

邱偉芬1，張昌娟1，文 良2，方 勇1，胡秋輝1

（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京210023；2.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳518045）

采用QuEChERS方法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立大米中是否存在敵敵畏、草滅達、氧化樂果、五氯硝基苯、敵稗、甲基毒死蜱、殺螟硫磷、甲基吡啶磷、馬拉硫磷、毒死蜱、稻豐散、腐霉利、丁草胺、稻瘟靈、三唑磷、聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯17種農(nóng)藥的快速篩查方法。樣品采用體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸-乙腈提取、無水硫酸鎂與氯化鈉鹽析，經(jīng)N-丙基乙二胺和十八烷基鍵合硅膠凈化，氣相色譜-質(zhì)譜檢測，NAGINATA?軟件分析。結(jié)果表明：17種農(nóng)藥在大米中檢出限為0.002～0.050 mg/kg。在0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg添加水平的平均回收 率為80%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～12.3%。該方法耗時短，操作便捷、快速且可靠，適合大米中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查。采用本方法對25份大米樣品進行測定，檢測出毒死蜱、三唑磷和稻瘟靈3種農(nóng)藥殘留，殘留量均顯著低于GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)。

QuEChERS；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；NAGINATA?軟件；農(nóng)藥殘留

水稻是我國主要糧食作物之一，我國有半數(shù)以上的人以大米為主食。隨著人們生活水平的提高，對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題也越來越關(guān)注。為了保障廣大消費者的飲食安全，聯(lián)合國糧農(nóng)組織嚴(yán)格規(guī)定了食品中農(nóng)藥最大殘留限量。因此，開發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)已成為各國學(xué)者競相研究的熱點。農(nóng)藥殘留檢測的傳統(tǒng)方法主要有：液液萃取、索氏提取、磺化、消化等[1-2]。近年來，經(jīng)各國科研工作者多年的探索研究，農(nóng)藥殘留檢測的方法由單殘留檢測逐漸發(fā)展為多殘留檢測，檢測的儀器從氣相色譜（gas chromatography，GC）[3-4]和高效液相色譜[5-6]檢測為主導(dǎo)逐漸向GC-質(zhì)譜（GC-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用[7-11]液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[12-14]為主導(dǎo)轉(zhuǎn)變。GC-MS既具有GC的高分辨率，又具有MS檢測高靈敏度的優(yōu)點，可以同時準(zhǔn)確快速地測定樣品中多種風(fēng)險化合物，已經(jīng)被許多國家認(rèn)可并應(yīng)用。前處理技術(shù)是農(nóng)藥殘留分析工作研究的重點，主要存在操作時間長、過程繁瑣、溶劑消耗大等問題。2 003年Lehotay等[15]提出了QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）方法，該方法于2 007年成為美國官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會（association of official analytical chemists，AOAC）標(biāo)準(zhǔn)方法（AOAC Official Method 2007.01），2008年成為歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會的標(biāo)準(zhǔn)方法（EN 15662）[16]。Wilkowska[17]、Diez[18]等介紹了從20世紀(jì)60年代至今農(nóng)藥檢測方法的發(fā)展歷程，指出QuEChERS方法的優(yōu)勢在于溶劑消耗少、樣品前處理過程快速以及農(nóng)藥檢測范圍廣。

NAGINATA?軟件是在Kadokami等[19]研究基礎(chǔ)上建立的一款簡單經(jīng)濟的篩查程序。這個軟件是在安捷倫6890 A-5973C和7890 A-5975C型號GC-MS聯(lián)用的數(shù)據(jù)分析軟件上作為一個附加的軟件包使用的，使用NAGINATA?軟件不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，直接通過校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)庫就可以評估藥物和農(nóng)藥的含量[20-21]。在檢測樣品之前使用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行系統(tǒng)性能評估來彌補儀器和日常條件的變化。樣品在GC-MS中運行后，自動的化合物搜索（基于校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)庫，包括化合物的保留時間、校正曲線和電子碰撞電離質(zhì)譜），然后快速確認(rèn)，得到所有化合物的初步定量分析結(jié)果[22-23]。該系統(tǒng)顯著提高了農(nóng)藥識別的精確度和速度，對于突發(fā)事件的應(yīng)急工作，可以縮短樣品的分析時間，提高檢測篩查的工作效率。

目前NAGINATA?系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用于水樣[24]和血液樣品[25]的風(fēng)險物檢測，而在大米樣品的風(fēng)險物檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少。本研究將QuEChERS方法與GC-MS、NAGINATA?軟件結(jié)合，充分發(fā)揮了二者快速準(zhǔn)確的特點，不僅縮短了樣品前處理和檢測分析所需時間，而且提高了定性結(jié)果的準(zhǔn)確度，從而實現(xiàn)了對大米中農(nóng)藥殘留的快速準(zhǔn)確的篩查。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

大米樣品江蘇省糧食局糧油質(zhì)量監(jiān)測所；17種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙腈（農(nóng)殘級）美國Tedia公司；混合內(nèi)標(biāo)物（4-氯甲苯-d4、1,4-二氯苯-d4、萘-d8、氘代苊、菲-d10、熒蒽-d10、氘代屈、二萘嵌苯-d12）純藥工業(yè)株式會社；十氟三苯基膦（decafluorotriphenylphosphine，DFTPP）美國Supelco公司；分散固相萃取填料（硫酸鎂、N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18））美國安捷倫公司。

1.2儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS儀美國安捷倫公司；NAGINATA?軟件環(huán)亞高科（北京）科技發(fā)展有限公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機美國貝克曼公司；QL-902渦旋混合儀海門市齊林貝爾儀器制造有限公司；高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品制備

樣品前處理方法參照Nguyen[10]、Lehotay[15]等的方法并稍作改進。大米樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過60目篩備用。準(zhǔn)確稱取7.50 g大米樣品于50 mL離心管中，加入15 mL超純水（4 ℃），混合均勻后在4 ℃冰箱中凈置30 min，加入15 mL乙腈（4 ℃且含有體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸），渦旋1 min；加入6.00 g無水硫酸鎂和1.50 g氯化鈉，立即振搖1 min，4 ℃離心10min（5 000 r/min）；取上清液6 mL，放入預(yù)先裝有400 mg PSA、400 mg C18和1 200 mg無水硫酸鎂的離心管中，立即渦旋1 min，4 ℃離心5 min（5 000 r/min）；取上清液3 mL，50 ℃氮吹濃縮至干，加入含有1 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)物的丙酮，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，GC-MS分析。

1.3.2儀器條件

1.3.2.1 GC條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250℃；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min升至150 ℃，以3 ℃/min升至200 ℃，以8 ℃/min升至280 ℃，保持10 min，以20 ℃/min升至300 ℃，并保持10 min；載氣：氦氣，流速1.2 mL/min；進樣量2 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.3.2.2 MS條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度150 ℃；MS調(diào)諧方式：DFTPP調(diào)諧；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550；掃描速率2.86 scan/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 17種農(nóng)藥的總離子流色譜圖

實驗選取了17種代表性農(nóng)藥作為前處理技術(shù)的研究對象，包括有機氯類、菊酯類、有機磷類和有機氮農(nóng)藥，這些都是水稻種植過程中可能會使用的一些農(nóng)藥。17種農(nóng)藥在NAGINATA?三元組數(shù)據(jù)庫的保留時間、目標(biāo)離子和定量離子見表1。在設(shè)定的檢測條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1，各色譜峰分離效果理想。

表1 17 種農(nóng)藥的保留時間、目標(biāo)離子和定量離子Table 1 Retention times, target ions and qualifier ions of 17 pesticides

圖1 17 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of mixture of 17 pesticide standards

2.2樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1萃取劑的選擇

本實驗對提取溶劑的種類進行考察。分別比較了正己烷、丙酮、乙腈以及含體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸-乙腈溶液，用丙酮提取時共提物中雜質(zhì)較多，對于檢測儀器維護帶來困難，并且丙酮與水互溶，難以與水分離。正己烷雖然基本與水不互溶易于分離，但是正己烷是非極性溶劑，對有機磷類農(nóng)藥的提取率低。而采用乙腈提取得到了較好的結(jié)果，干擾物質(zhì)較少，并且與水易分離?？紤]到酸堿敏感性農(nóng)藥的穩(wěn)定性，最終選擇1%冰乙酸-乙腈為萃取溶劑。

2.2.2溫度控制

在樣品制備過程中，由于添加無水硫酸鎂（其水化反應(yīng)是一個高度放熱的過程，溫度會上升超過45℃），熱穩(wěn)定性較差的農(nóng)藥會因為溫度的上升而回收率下降。通過添加4℃乙腈和超純水方式將提取溫度控制在較低水平，來提高熱穩(wěn)定性差農(nóng)藥的回收率，如氧化樂果（圖2）。雖然在氮吹濃縮過程中水浴的溫度也達到了50℃，但是對熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥的回收率無影響。這說明氧化樂果的回收率低是由于無水硫酸鎂加入后的溫度瞬間上升引起的。因此通過控制提取過程的溫度來提高熱穩(wěn)定性差農(nóng)藥的回收率。

圖2 不同提取溫度對農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on recoveries of 17 pesticides

2.2.3凈化劑的選擇

PSA是一種弱陰離子交換劑，可以有效地去除各種有機酸、脂肪酸和一些糖類，而C18能吸收脂質(zhì)。大米是水分含量低、脂肪酸含量相對較高的基質(zhì)。本實驗比較了現(xiàn)在主流的2種凈化方法AOAC和EN去除脂肪酸的能力，AOAC方法在凈化過程中使用400 mg PSA、400 mg C18和1 200 mg無水硫酸鎂，而EN方法使用了150 mg PSA、150 mg C18和900 mg無水硫酸鎂。大米在不同凈化條件下的總離子流圖見圖3，大米中基質(zhì)共提物出峰時間集中在20～30 min，AOAC方法的凈化效果明顯優(yōu)于EN方法。AOAC方法凈化能力的增強，是由于PSA和C18的含量增多。AOAC方法能明顯減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，且吸附劑對農(nóng)藥的回收率沒有影響，所以選擇AOAC方法為最佳凈化條件。

圖3 大米樣品在不同凈化條件下的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of rice samples under different purification conditions

2.3檢出限、回收率和精密度

根據(jù)歐盟農(nóng)藥殘留分析質(zhì)量控制程序要求，農(nóng)藥平均回收率在70%～120%之間，重復(fù)性低于20%。在大米中進行添加回收率實驗，添加水平分別為0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg，大米樣品中添加0.10 mg/kg農(nóng)藥標(biāo)品的譜圖見圖4，添加回收率結(jié)果見表2，大米中3個水平的添加回收率在80%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.7%～12.3%之間。以3倍信躁比確定方法檢出限為0.0 0 2～0.050 mg/kg，均符合分析要求。

圖4 大米樣品加標(biāo)的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatograms of pesticide standards spiked into rice sample

表2 大米中添加17 種農(nóng)藥標(biāo)樣的回收率、檢出限及RSD（ =5）Table 2 Recoveries, limit of detection and RSD of 17 pesticides spiked in rice ( = 5)

2.4實際應(yīng)用

采用本方法對我國江蘇省常州、南京、無錫、鎮(zhèn)江、泰州、南通、徐州、鹽城和淮安的25份大米樣品進行農(nóng)藥的篩查檢測，檢出了3種農(nóng)藥分別是毒死蜱、三唑磷和稻瘟靈，含量在0.031～0.045 mg/kg之間。GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定大米中毒死蜱、三唑磷和稻瘟靈的最大殘留限量分別為0.5、0.05 mg/kg和1 mg/kg，檢出的農(nóng)藥殘留水平 均低于國家最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，篩查樣品全部合格。

3 結(jié) 論

本研究采用QuEChERS方法結(jié)合GC-MS聯(lián)用和NAGINATA?軟件建立了大米中農(nóng)藥多殘留的測定方法，獲得了理想的色譜分離效果和較高的檢測靈敏度。方法的檢出限為0.002～0.050 mg/kg，在0.05、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg添加水平的回收率范圍為80%～110%，RSD為1.7%～12.3%，均滿足歐盟農(nóng)藥殘留分析質(zhì)量控制程序?qū)Υ竺字卸喾N農(nóng)藥殘留分析的要求。與傳統(tǒng)方法相 比，無需配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，縮減了時間、減少了人為誤差。

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Rapid Determination of Pesticide Multi-Residues in Rice by QuEChERS and GC-MS

QIU Weifen1, ZHANG Changjuan1, WEN Liang2, FANG Yong1, HU Qiuhui1
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China; 2. Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China)

The combination of QuEChERS and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was employed to establish a new method for the rapid screening 17 pesticide residues in rice, including dichlorvos, molinate, omethoate, quintozene, propanil, chlorpyrifos-methyl, fenitrothion, pirimiphos-methyl, malathion, chlorpyrifos, phenthoate, procymidone, butachlor, isoprothiolane, triazophos, bifenthrin and deltamethrin. Samples were extracted with a mixture of acetonitrile/acetic acid (99:1, V/V) and salted out with anhydrous MgSO4and NaCl. After the incorporation of N-propyl ethylenediamine (PSA) and C18sorbent for the purifi cation process, GC-MS and NAGINATA? software were used for the detection and analysis, respectively. The results showed that the limits of detection (LOD) of the 17 pesticide residues using the established method were in the range of 0.002–0.050 mg/kg, and their average recovery rates in a blank sample were 80%–110% with rela tive standard deviations (RSDs) of 1.7%–12.3%. This method was sensitive without the need for any complicated pre-treatments or expensive equipment and was suitable for the fast screening of pesticide residues in rice. Finally, we adopted the new method to detect pesticide residues in 25 rice samples. The results showed that 3 pesticides including chlorpyrifos, triazophos and isoprothiolane were analyzed, and their levels were lower than the MRL stipulated by the national standard of China (GB 2763—2014).

QuEchERS; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); NAGINATA? software; pesticide residues

O657

A

1002-6630（2015）12-0221-05

10.7506/spkx1002-6630-201512042

2015-02-08

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）；

農(nóng)產(chǎn)品中化學(xué)風(fēng)險物高速分析檢測系統(tǒng)的引進及其創(chuàng)新應(yīng)用項目（農(nóng)業(yè)部948項目；2015-Z47）

邱偉芬（1965—），女，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：weifenqiu711@163.com