角鯊烯國家標準樣品的研制

陳偉珠，晉文慧，方 華，謝全靈，張怡評，洪 專,*

（1.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.廈門大學化學化工學院，化學生物學福建省重點實驗室，福建 廈門 361005）

角鯊烯國家標準樣品的研制

陳偉珠1,2，晉文慧1，方 華1，謝全靈1，張怡評1，洪 專1,*

（1.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.廈門大學化學化工學院，化學生物學福建省重點實驗室，福建 廈門 361005）

為研制角鯊烯國家標準樣品。以角鯊烯粗品為原料，制備高純角鯊烯，采用紅外光譜、高分辨質譜和核磁共振譜進行結構確證。樣品分裝成150 瓶后，采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器法進行均勻性、穩(wěn)定性檢驗和定值分析。從樣品中隨機抽取15 瓶進行均勻性檢驗，經F檢驗表明在95%置信區(qū)間范圍內樣品均勻性良好；穩(wěn)定性考察按照-18 ℃長期實驗穩(wěn)定性（24 個月）進行，結果表明在考察期間內樣品穩(wěn)定性良好；標準樣品經國內8 家具有分析資質的實驗室進行協(xié)同定值，并評定了定值結果的不確定度，角鯊烯標準樣品定值結果為99.57%，相對擴展不確定度為0.30%（k=1.96）。該標準樣品達到國家標準樣品的技術要求，可用于有關角鯊烯的方法校正和質量控制。

角鯊烯；標準樣品；氣相色譜-氫火焰離子化法；定值；不確定度

角鯊烯，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯，是一種天然的開鏈三萜烯類、多不飽和脂肪族烴類化合物，含有6 個非共軛雙鍵，是由日本化學家于1906年在鯊魚的肝油中發(fā)現的，是人類從動物組織中最早發(fā)現的烴類化合物[1-2]，其化學名稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯[3]。目前，角鯊烯主要來自于深海鯊魚肝油，同時也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含量較多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量的角鯊烯[4-5]。角鯊烯在體內參與膽固醇的生物合成及多種生化反應，促進機體新陳代謝，提高機體的防御機能及應激能力，具有抗衰老、抗腫瘤和提高免疫調節(jié)等多種生理功能，可廣泛地應用于化妝品、醫(yī)藥、食品等多個行業(yè)[6-7]。市場上角鯊烯相關的產品不計其數，產品中角鯊烯的含量檢測需要角鯊烯標準樣品作為檢測對照；且在角鯊烯的相關研究和開發(fā)中，也需要角鯊烯標準樣品作為檢測基準，但是目前國內外尚無角鯊烯標準樣品。因此迫切需要開展角鯊烯標準樣品的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷、甲醇（均為色譜純） 德國默克公司；實驗用水均來自Milli-Q純水系統(tǒng)。

1.2 儀器與設備

7890A系列氣相色譜（gas chromatography，GC）儀（配有氫火焰離子檢測器（flame ionization detection，FID）） 美國Aglient公司；HP-8452型紫外-可見分光光度計 美國惠普公司；Nicolet Ftir-670型紅外光譜儀美國Thermo Scientific公司；LCT PremierTMXE型高分辨質譜儀 美國Waters公司；AL/104型天平 瑞士梅特勒-托利多集團；Milli-Q純水機 美國Milli-Pore公司；New style半制備液相儀 江蘇漢邦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 角鯊烯樣品的制備

圖1 角鯊烯粗品的高效液相色譜圖（A）和單體的GC圖（B）Fig.1 Semi-preparative HPLC and GC profiles of squalene

以角鯊烯粗品為原料，經高效液相色譜純化分離，收集主峰，去純溶劑，獲得角鯊烯單體。制備角鯊烯樣品液相色譜條件：SB-C18色譜柱（150 mm×21.2 mm， 4.6 μm）；流動相：甲醇；檢測波長210 nm；流速15 mL/min；進樣量0.5 mL；樣品質量濃度10 mg/mL（正己烷溶解）。

制備角鯊烯樣品液相色譜圖如圖1A所示，角鯊烯主峰約在22 min出峰，收集該主峰流出液，去除溶劑，得到的角鯊烯單體經GC法檢測，純度大于99%，色譜圖見圖1B。

1.3.2 定性分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質譜及核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）譜等對角鯊烯標準樣品進行定性分析。

1.3.3 定值分析

標準樣品定值一般情況下采用技術有效、嚴謹認可的方法來完成。目前，關于角鯊烯檢測方法有GC法[8-13]、GC-質譜法[14-16]、高效液相色譜法[2,7,17-20]以及超高效液相色譜法[21]，但是尚無統(tǒng)一的國家標準或行業(yè)標準，所以本實驗參考文獻[10]采用GC-FID法。

GC-FID條件：HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱流量1.0 mL/min；分流進樣（分流比1∶30）；進樣量1 μL；進樣口溫度300 ℃；升溫程序：初始柱溫160 ℃，保持2 min，以速率15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持8 min；FID溫度330 ℃；進樣口壓力15 psi；載氣為高純氮氣（99.999%），流速1 mL/ min，尾吹25 mL/ min；燃燒氣：氫氣，流速30 mL/ min；助燃氣：空氣，流速400 mL/min。

1.3.4 樣品配制

取本品10 mg置于10 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，即得。

1.3.5 均勻性檢驗

標準樣品均勻性是指特性量值在空間分布的均勻程度，它是對標準物質樣品總體空間分布的評價，是標準樣品的重要質量指標之一。對同一批制備的角鯊烯樣品進行分裝，每瓶標準樣品凈質量為50 mg，共150 瓶。按照GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[22]規(guī)定，本項目確定抽樣數目為15 個，采用單因素多水平試驗方差分析法對角鯊烯標準樣品進行純度均勻性檢驗，測定方法采用GCFID，每個樣品重復測3 次。檢測數據用方差分析法進行分析以判斷標準樣品的均勻性是否合格。

1.3.6 穩(wěn)定性檢驗

考察樣品的穩(wěn)定性，確定其有效期，取本標準樣品模擬上市包裝，進行-18 ℃、24 個月長期實驗，分別于0、1、3、6、9、12、18、24 個月取樣檢測，通過考察標準樣品純度的變化來研究樣品的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性檢測方法與均勻性檢測的方法相同，均采用GC-FID法，每份樣品連續(xù)進樣2 次，然后用歸一法求出其純度的平均值。

2 結果與分析

2.1 角鯊烯的定性分析

角鯊烯通過紅外光譜、高分辨質譜及NMR譜進行定性分析。

2.1.1 角鯊烯的紅外光譜分析

表1 角鯊烯紅外光譜數據表Table 1 IR spectral parameters of squalene

如表1所示，波數為2 969、2 854、1 380 cm-1說明樣品結構中存在CH3。波數為2 922、1 443 cm-1說明樣品結構中存在與雙鍵相連的CH2。波數為1 666、835 cm-1說明樣品結構中存在三取代的烯烴。

2.1.2 角鯊烯的高分辨質譜分析

高分辨質譜測得的角鯊烯加鈉離子[C30H50+Na]+精確質荷比為m/z 433.379 7，與理論值（433.380 5）一致。

2.1.3 角鯊烯的NMR圖譜分析

對該樣品進行NMR測試，核磁數據見表2。與文獻[23]報道的角鯊烯核1H NMR圖譜和13C NMR圖譜等數據一致。從樣品的紅外光譜、高分辨質譜和NMR譜證明了所研制的樣品是角鯊烯，結構式見圖2。

圖2 角鯊烯的化學結構式Fig.2 Chemical structure of squalene

表2 角鯊烯的NMR數據表Table 2 NMR data of squalene

2.2 均勻性檢驗結果

標準樣品的均勻性檢驗是標準樣品研制過程中不可缺少的程序。因此在對樣品進行分裝后，對角鯊烯標準樣品進行純度均勻性檢驗，均勻性檢驗結果見表3、4。

表3 角鯊烯標準品純度均勻性檢驗結果Table 3 Homogeneity of purified squalene%

表4 角鯊烯均勻性方差分析的結果Table 4 Results of variance analysis for the homogeneity of squalene

統(tǒng)計量F值為1.75，小于F0.05（14,30）值2.04，說明在95%的置信區(qū)間，角鯊烯樣品均勻性良好。

2.3 穩(wěn)定性

取本標準樣品，模擬上市包裝，在溫度-18 ℃條件下放置24 個月，分別于0、1、2、3、6、9、12、18、24 個月取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目檢測實驗結果見表5。根據GB/T 15000.3—2008的要求，采用直線模型作為經驗模型，對長期穩(wěn)定性獲得的數據進行分析。

表5 角鯊烯樣品在—18 ℃貯存條件下的穩(wěn)定性Table 5 Stability of squalene at-1188 ℃

斜率b1按公式（1）計算：

式中：Xi為每次檢測時間/月；Yi為每次檢測純度/%；為每次檢測時間總和/間隔檢測次數（X=10.29月）；為檢測純度結果的平均值（）。

截距b0按公式（2）計算：

直線上點的標準差按公式（3）計算：

式中：n-2為自由度。

取其平方根S為0.042 802%，與斜率相關的不確定度按公式（4）計算：

自由度為n-2和P=0.95（95%置信水平）的學生t因子等于2.571。由于|b1|＜t0.95(n-2)×s（b1）= 2.571×0.002 066%=0.005 311%，故斜率是不顯著的。因而未觀測到不穩(wěn)定性。長期實驗穩(wěn)定性的不確定度貢獻度即成為：ults=sb×t=0.002 066%×24=0.05%。直線模型分析的結果，表明角鯊烯標準樣品在低溫密閉環(huán)境中保存2 a穩(wěn)定性良好。這說明在實際保藏條件下（-18 ℃），角鯊烯的有效期可定為2 a。

2.4 定值結果及其不確定度評定

2.4.1 定值結果

本標準樣品按照GB/T 15000.3—2008要求，采用多個實驗室協(xié)作實驗定值，選擇獲得國家或部門認可的、具備資質的8 家實驗室進行樣品定值。隨機抽取8 瓶樣品，每個定值實驗室送1 瓶，采用GC-FID法進行測定，應用面積歸一法進行定值，定值結果見表6。

表6 角鯊烯的定值結果Table 6 Certification results of squalene%

匯集各家實驗室的檢測數據后，對每家實驗室的數據按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗組內數據的異常值。沒有異常值，所有數據進行下一步統(tǒng)計，再用Grubb’s法對每家實驗室的平均值進行檢驗，將其看成一組測定值進行異常值檢驗，無異常值。因此將各家實驗室測得的數據作為無偏估計值，計算8 家測定結果的平均值及標準差。然后對各實驗室測定結果的標準差進行Cochran檢驗，按公式（5）計算統(tǒng)計量：

式中：Si為各實驗室測定結果的標準差；Smax為Si中的最大值。表明各實驗室間的測量不屬于等精度測量，因此計算加權平均值作為最佳值得到角鯊烯標準樣品的定值結果?？偲骄祒=99.57%。

2.4.2 定值結果的不確定度評定

根據GB/T 15000.3—2008規(guī)定，定值結果由標準值和不確定度組成。標準樣品特性標準值的測量不確定度UCRM由標準值定值實驗的不確定度U（x）、均勻性檢驗的不確定度Ubb和穩(wěn)定性檢驗的不確定度Ults組成。依據全部測定結果，計算角鯊烯標準樣品的特性標準值和不確定度。

標準樣品定值的不確定度為Uchar=0.14%。

均勻性檢驗的不確定度Ubb：瓶間方差按公式（6）計算：

式中：組間均方差、組內均方差數據來自表4。

瓶間標準差是該方差的平方根：

穩(wěn)定性檢驗的不確定度Ults：由2.3節(jié)穩(wěn)定性檢驗實驗可知，ults=sb×t=0.002 066%×24=0.05%，標準樣品定值結果的不確定度為擴展不確定度為U95=kU=1.96×0.15%=0.30%。

通過上述統(tǒng)計學數據處理，角鯊烯標準樣品的特性值定值結果為：特性標準值99.57%，置信度為95%的擴展不確定度值為0.30%。

3 結 論

研制角鯊烯標準樣品，對其進行了均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察。考察結果表明該標準樣品符合標準樣品均勻性與穩(wěn)定性的要求。研制的角鯊烯標準樣品對食品安全、環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生檢驗檢疫等方面的測量和科學研究提供了技術支撐和量值溯源保證，具有重要意義。

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Development of Squalene Certified Reference Material

CHEN Weizhu1,2, JIN Wenhui1, FANG Hua1, XIE Quanling1, ZHANG Yiping1, HONG Zhuan1,*
(1. Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China; 2. The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Squalene certified reference material was developed by purification of crude squalene. The structure of the certifi ed reference material was confi rmed by infrared spectroscopy (IR), high resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NRM) and squalene was divided into 150 aliquots. The homogeneity and stability tests and quantitative analysis were carried out by gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID). Fifteen randomly selected aliquots showed good homogeneity as indicated by F-test analysis at a 95% confi dence interval. The test samples were stable at -18℃for 24 months. A cooperative certifi cation was conducted with 8 qualifi ed laboratories. The certifi ed purity value of the reference material was 99.57% with a relatively expanded uncertainty of 0.30% (k = 1.96). The reference material can conform to the technical requirement of the certifi ed reference material. This material was intended for use in the method validation and quality control regarding squalene.

squalene; certified reference material; gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID); certification; uncertainty

P745

A

1002-6630（2015）12-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201512031

2014-10-30

廈門海洋研究開發(fā)院共建項目（2014）；海洋生物技術產業(yè)化中試技術研發(fā)公共服務平臺項目（12PZP001SF10）；廣東海洋經濟發(fā)展區(qū)域示范項目（GD2012-D01-001）

陳偉珠（1981—），女，助理研究員，碩士，研究方向為海洋天然產物標準樣品研制與分析。E-mail：wzchen@tio.org.cn

*通信作者：洪專（1970—），男，高級工程師，博士，研究方向為海洋天然產物。E-mail：hzh@tio.org.cn