紫薯中綠原酸類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的制備

李 甫，陳 斌，李聯(lián)洪，王明奎

（1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.成都曼思特生物科技有限公司，四川 成都 610000）

紫薯中綠原酸類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的制備

李 甫1，陳 斌1，李聯(lián)洪2，王明奎1

（1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.成都曼思特生物科技有限公司，四川 成都 610000）

從紫薯中提取制備高純度、市場(chǎng)價(jià)值較高的綠原酸類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品。紫薯切片，采用沸水提取、大孔樹(shù)脂吸附和凝膠柱色譜分段，然后以反相制備液相色譜獲得高純標(biāo)準(zhǔn)品，最后以核磁共振技術(shù)確定化學(xué)結(jié)構(gòu)。從紫薯中制備得到異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和3,4,5-O-三咖啡?；鼘幩幔咝б合嗌V檢測(cè)表明這些化合物的純度均在98%以上。本研究建立的制備工藝可高效地將紫薯中綠原酸類(lèi)化合物富集，并快速獲得高純樣品，有效地避免了紫薯花色苷類(lèi)化合物對(duì)產(chǎn)品色澤和純度的影響。

紫薯；綠原酸類(lèi)化合物；標(biāo)準(zhǔn)品；分離；制備

紫薯（Ipomoea batatas L.）為旋花科甘薯屬草本植物，一般認(rèn)為其原產(chǎn)于熱帶美洲或中美洲，世界上許多熱帶或亞熱帶地區(qū)都有廣泛種植。在一些發(fā)展中國(guó)家，紫薯已經(jīng)成為一種主要的糧食作物。就世界范圍而言，紫薯已成為小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、大麥和木薯之后排名第七的主食[1]。研究表明，紫薯含有多種功能性成分，如花青素[2-7]、咖啡酸類(lèi)化合物[8-10]、黃酮[11]、多糖[12]、游離氨基酸[13]、有機(jī)硒[14]和蛋白質(zhì)等[15]，因此，紫薯具有多種生理保健功能，如抗癌[16-17]、降血糖[18-19]、降血壓[20]、抗氧化[21-22]等。

紫薯中的綠原酸類(lèi)化合物主要為咖啡?；鼘幩犷?lèi)化合物，這類(lèi)化合物生物活性好，是許多中藥材（如金銀花）和相關(guān)藥品的主要活性成分，常被用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)藥材和藥品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。然而，部分該類(lèi)成分，如異綠原酸B、異綠原酸C和3,4,5-三咖啡?；鼘幩嵩趥鹘y(tǒng)藥材中的含量較低，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，關(guān)于這些化合物標(biāo)準(zhǔn)品制備工藝鮮有報(bào)道。已有研究和筆者高效液相色譜分析結(jié)果表明，紫薯中這些化合物的含量較高，是大量獲得其高純樣品的優(yōu)質(zhì)資源[8]。但是，研究發(fā)現(xiàn)紫薯中的花青素類(lèi)化合物在多數(shù)分離材料上拖尾現(xiàn)象非常嚴(yán)重，直接影響綠原酸類(lèi)化合物最終產(chǎn)品的色澤和純度。有文獻(xiàn)報(bào)道采用高速逆流色譜技術(shù)從紫薯中分離得到綠原酸和異綠原酸A，但是這兩個(gè)化合物在山銀花等藥材中含量同樣較高，市場(chǎng)價(jià)值不大，且異綠原酸A的純度尚未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品的要求，其對(duì)最終產(chǎn)品的色澤也沒(méi)有明確說(shuō)明[23]。為此，本實(shí)驗(yàn)研究從紫薯中獲取色澤較好、純度大于98%的一系列綠原酸類(lèi)成分的生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

紫薯KX-3 四川紫金都市農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

乙腈（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、3,4,5-三咖啡?；鼘幩針?biāo)準(zhǔn)品 成都曼思特生物科技公司；D72大孔樹(shù)脂天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司；Sephadex LH-20凝膠北京綠百草科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20AT液相色譜分析儀（配有自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測(cè)器） 日本島津公司；LC-6000型制備高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；Ascend 400M核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.3方法

1.3.1 色譜條件

分析色譜條件：分析型色譜柱：依利特Sinachrom ODS BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-水-醋酸（22∶73∶5，V/V）；進(jìn)樣量：20 μL。

制備色譜條件：制備色譜柱：Daiso-ODS-BP（50 mm×250 mm，10 μm）；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：80 mL/min；一次制備流動(dòng)相：乙腈-水-醋酸（20∶75∶5，V/V）；二次制備流動(dòng)相：乙腈-水-醋酸（18∶77∶5，V/V）。

1.3.2 制備色譜條件的建立

實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相組成對(duì)紫薯中綠原酸類(lèi)化合物分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇-酸水體系對(duì)該類(lèi)化合物的分離度較差，重疊較為嚴(yán)重，而乙腈-酸水體系分離度較好，所以選擇乙腈-酸水體系作為制備溶液。

二極管陣列檢測(cè)器表明綠原酸類(lèi)化合物的最大吸收波長(zhǎng)為326 nm，花色苷類(lèi)化合物的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm和530 nm，考慮到該組分主要為綠原酸類(lèi)成分、花色苷類(lèi)成分含量較低、制備液相檢測(cè)器靈敏度不高等因素，將制備液相波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm，以有效地檢測(cè)到微量的花色苷化合物，獲得高純度的綠原酸類(lèi)化合物單體。

流速的確定取決于分離度、填料性能和泵的工作能力，綜合考慮這3方面因素，本實(shí)驗(yàn)分別考察60、80、100 mL/min流速條件下的分離情況，確定流速80 mL/min最為合適。

1.3.3 紫薯綠原酸類(lèi)化合物的提取與純化

紫薯（5 kg）切薄片，以沸水提取3 次（20 L/次），每次提取時(shí)間10 min，提取液過(guò)濾，濾液加濃鹽酸至pH 3，該溶液通過(guò)D72大孔樹(shù)脂，純水洗脫至洗脫液無(wú)色，換用甲醇洗脫至樹(shù)脂無(wú)色，甲醇洗脫液濃縮至干，得紅色洗脫物43 g。取20.0 g該洗脫物溶于50 mL 0.5%醋酸水溶液進(jìn)行Sephadex LH-20柱層析，先用40%甲醇（含0.5%醋酸）溶液洗脫，色譜柱中呈現(xiàn)出3 條色帶，均為紫薯花色苷類(lèi)化合物，依次接收得組分1～3，再以80%甲醇（含0.5%醋酸）溶液洗脫得紫薯綠原酸類(lèi)化合物（組分4）。

1.3.4 紫薯綠原酸類(lèi)化合物的制備

取2.0 g組分4溶于10 mL制備液中，過(guò)濾，采用1.3.1節(jié)制備液相條件的方法進(jìn)行制備，根據(jù)峰形收集13～30 min流出液，60 ℃減壓濃縮干燥，得化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。

1.3.5 純度檢測(cè)

以1.3.1節(jié)中的分析色譜方法進(jìn)行純度測(cè)定，采用面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 結(jié)構(gòu)鑒定

采用1H-NMR和13C-NMR技術(shù)對(duì)4 個(gè)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，化合物1、2和3用CD3OD溶解，化合物4用二甲基亞砜-d6溶解，核磁共振頻率400 MHz。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯中綠原酸類(lèi)化合物與花色苷類(lèi)化合物的初級(jí)分離

紫薯的主要化學(xué)成分為花色苷和綠原酸類(lèi)化合物，花色苷類(lèi)化合物為紅色，綠原酸類(lèi)成分為白色，因此，首先要實(shí)現(xiàn)兩者的有效分離，避免花色苷類(lèi)化合物影響綠原酸類(lèi)化合物的色澤和純度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花色苷類(lèi)化合物在正相硅膠和反相硅膠上拖尾都非常嚴(yán)重，而且在這兩種分離材料上花色苷和綠原酸類(lèi)似物分離度不好，重疊較為嚴(yán)重，這兩種分離材料并不適合兩者的初級(jí)分離。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sephadex LH-20凝膠柱對(duì)紫薯花色苷和綠原酸類(lèi)化合物具有很好的分離度，而且花色苷類(lèi)化合物在凝膠上幾乎沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，色帶非常集中，因此選用Sephadex LH-20凝膠有效地實(shí)現(xiàn)兩者的分離。

在1.3.3節(jié)條件下，獲得3 個(gè)主要含有紫薯花色苷的組分1（1.4 g）、組分2（1.9 g）和組分3（8.2 g），同時(shí)獲得主要含有紫薯綠原酸類(lèi)化合物的組分4（7.9 g）。

2.2 色譜峰的收集和樣品的高效液相色譜分析

一次制備時(shí)采用中心切割法對(duì)4 個(gè)色譜峰分別進(jìn)行收集（圖1）。峰3和峰4的分離度較好，僅一次制備就可以獲得98%以上的純品；峰1和峰2有部分重疊，一次制備獲得產(chǎn)品純度不夠，需二次制備，二次制備時(shí)將流動(dòng)相中的乙腈比例適當(dāng)降低，延長(zhǎng)峰1和峰2的保留時(shí)間，使兩者基本達(dá)到基線(xiàn)分離，獲得純度合格的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

圖1 紫薯組分4制備液相色譜圖Fig.1 Preparative high performance liquid chromatography of fraction 4 from sweet purple potato

圖2 化合物1（a）、2（b）、3（c）、4（d）的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of compounds 1 (a), 2 (b), 3 (c) and 4 (d)

在1.3.4節(jié)的分離制備條件下，從2.0 g組分4中分離得到化合物1（峰1）115.3 mg、化合物2（峰2）148.8 mg、化合物3（峰3）45.1 mg、化合物4（峰4）7.3 mg。采用面積歸一法計(jì)算這些化合物的純度依次為99.9%、 99.7%、99.9%和98.2%，均高于98.0%，符合標(biāo)準(zhǔn)品的要求（圖2）。

2.3結(jié)構(gòu)鑒定

圖3 化合物1～4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of compounds 1 through 4

化合物1，白色粉末。1H-N M R（C D3O D，400 MHz）δ：5.62（1H，m，H-3）、5.12（1H，m，H-4）、4.39（1H，m，H-5）、2.31（1H，m，H-6）、2.21（2H，m，H-2）、2.12（1H，m，H-6）、7.58（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.52（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.02（H，d，J=1.8 Hz，H-2’,）、7.00（H，d，J=1.8 Hz，H-2’）、6.91（1H，d，J=8.0 Hz，H-6’）、6.89（1H，d，J=8.0 Hz，H-6’）、6.75（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.73（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.29（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）、6.18（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’’）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：76.2（C-1）、39.4（C-2）、69.2（C-3）、75.8（C-4）、69.3（C-5）、38.7（C-6）、176.9（C-7）、127.9（C-1’）、127.6（C-1’）、115.4（C-2’）、115.3（C-2’）、146.9（C-3’）、146.8（C-3’）、149.6（C-4’，4’）、116.6（C-5’）、116.5（C-5’）、123.2（C-6’）、1 2 3.1（C-6’’）、1 4 7.9（C-7’）、147.8（C-7’）、114.8（C-8’，8’）、168.8（C-9’）、168.3（C-9’）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的3,4-O-雙咖啡?；?奎寧酸的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為3,4-O-雙咖啡?；?奎寧酸，即異綠原酸B（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3）。

化合物2，白色粉末。1H-N M R（C D3O D，400 MHz）δ：5.42（1H，m，H-5）、5.39（1H，m，H-3）、3.96（1H，m，H-4）、2.30（1H，m，H-6）、2.17（2H，m，H-2）、2.15（1H，m，H-6）、7.60（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.56（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.06（2H，brs，H-2’，2’’）、6.94（1H，d，J=8.0 Hz，H-6’）、6.96（1H，d，J=8.2 Hz，H-6’）、6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.79（1H，d，J=8.2 Hz，H-5’）、6.35（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）、6.26（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：74.9（C-1）、37.7（C-2）、72.2（C-3）、7 0.8（C-4）、7 2.7（C-5）、3 6.2（C-6）、177.5（C-7）、128.1（C-1’）、127.9（C-1’’）、115.5（C-2’）、115.3（C-2’）、147.4（C-3’）、147.0（C-3’）、149.7（C-4’）、149.6（C-4’）、116.6（C-5’）、116.6（C-5’）、123.2（C-6’）、123.0（C-6’）、147.2（C-7’）、147.0（C-7’）、115.7（C-8’）、115.1（C-8’）、169.1（C-9’）、168.5（C-9’）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的3,5-O-雙咖啡?；?奎寧酸的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為3,5-O-雙咖啡?；?奎寧酸，即異綠原酸A（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3）。

化合物3，白色粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：5.42（1H，dd，J=8.2，3.2 Hz，H-5）、5.32（1H，m，H-4）、3.97（1H，m，H-3）、2.36（1H，m，H-6）、2.21（2H，m，H-2）、2.14（1H，m，H-6）、7.62（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.56（1H，d，J=16.0 Hz，H-7’）、7.06（2H，d，J=2.0 Hz，H-2’，H-2’）、6.97（2H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6’，6’）、6.79（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.35（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）、6.21（1H，d，J=16.0 Hz，H-8’’）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：74.1（C-1）、37.3（C-2）、69.5（C-3）、73.6（C-4）、72.1（C-5）、36.9（C-6）、176.8（C-7）、127.9（C-1’）、127.8（C-1’）、115.6（C-2’）、115.2（C-2’）、146.7（C-3’）、146.8（C-3’）、149.5（C-4’，4’）、116.6（C-5’）、116.5（C-5’）、123.1（C-6’）、123.0（C-6’）、147.0（C-7’）、146.9（C-7’）、115.0（C-8’）、114.8（C-8’）、169.3（C-9’）、168.5（C-9’）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的4,5-O-雙咖啡?；?奎寧酸的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為4,5-O-雙咖啡?；?奎寧酸，即異綠原酸C（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3）。

化合物4，白色粉末。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：5.38（2H，m，H-3，5）、5.28（1H，m，H-4）、2.17（1H，m，H-6）、2.06（2H，m，H-2）、1.93（1H，m，H-6）、7.50（2H，d，J = 16.0 Hz，H-7’，7’’）、7.33（1H，d，J = 15.9 Hz，H-7’）、7.19（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2’）、7.13（2H，d，J = 1.8 Hz，H-2’，2’’）、6.94（3H，m，H-6’，6’，6’’）、6.88（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5’）、6.75（2H，d，J = 8.0 Hz，H-5’，5’’）、6.38（2H，d，J = 16.0 Hz，H-8’，8’’）、6.26（1H，d，J = 15.9 Hz，H-8’）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：72.9（C-1）、35.7（C-2）、67.4（C-3）、70.5（C-4）、68.0（C-5）、36.6（C-6）、174.2（C-7）、125.4（C-1’，1’’）、125.3（C-1’）、114.8（C-2’）、114.5（C-2’，2’’）、145.0（C-3’）、144.8（C-3’）、144.6（C-3’’）、145.8（C-4’）、145.6（C-4’）、145.5（C-4’’）、115.3（C-5’，5’，5’’）、122.2（C-6’）、121.0（C-6’，6’’）、148.5（C-7’）、148.4（C-7’，7’）、113.9（C-8’）、113.8（C-8’，8’’）、165.8（C-9’）、165.7（C-9’）、165.4（C-9’’）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的3,4,5-O-三咖啡?；鼘幩岬暮舜艛?shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為3,4,5-O-三咖啡?；鼘幩幔ńY(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3）。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)得出Sephadex LH-20凝膠可有效地實(shí)現(xiàn)紫薯中花色苷和綠原酸類(lèi)化合物的分離，消除紫薯花色苷對(duì)綠原酸類(lèi)成分色澤和純度的影響，進(jìn)一步采用反相制備色譜快速、高效地獲得純度高于98.0%的異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和3,4,5-O-三咖啡?；鼘幩?。這些化學(xué)成分均具有廣泛的的生理活性，科研、工業(yè)需求高，然而除了異綠原酸A外，其他幾種物質(zhì)在傳統(tǒng)中藥材中雖有分布但普遍含量較低，因此市場(chǎng)價(jià)值較高。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，異綠原酸B和異綠原酸C在紫薯中含量較高，是大量獲取這兩種成分的理想原料。本研究建立的制備工藝具有產(chǎn)品色澤好、純度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、可用于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

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Preparation of High-Purity Chlorogenic Acid Derivatives from Purple Sweet Potato

LI Fu1, CHEN Bin1, LI Lianhong2, WANG Mingkui1
(1. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China; 2. Chengdu MUST Bio-technology Company Limited, Chengdu 610000, China)

The purpose of the present study was to prepare high-purity and high-value chlorogenic acid derivatives from purple sweet potato. Purple sweet potato slices were extracted with hot water. The extracted compounds were separated with D72 macroporous resin, sephadex LH-20 column chromatography and preparative high performance liquid chromatography (HPLC) to obtain high-purity chlorogenic acid analogues which were identifi ed as isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid C and 3,4,5-O-tricaffeoyl quinic acid, respectively, by nuclear magnetic resonance technique. HPLC analysis suggested that the purities of these analogues were all over 98%. The developed method can be used to rapidly obtain standard samples of chlorogenic acid derivatives from purple sweet potato, while avoiding effectively the negative effects of the anthocyanins on product color and purity.

purple sweet potato; chlorogenic acid derivative; standard sample; isolation; preparation

R284.2

A

1002-6630（2015）12-0133-05

10.7506/spkx1002-6630-201512025

2014-11-20

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012SZ0054）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAC09B04）

李甫（1979—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：lifu@cib.ac.cn