正交試驗優(yōu)化黃河鯉魚鱗酶促溶性膠原蛋白提取工藝

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（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

正交試驗優(yōu)化黃河鯉魚鱗酶促溶性膠原蛋白提取工藝

肖 楓1,2，朱文學1,*，康懷彬1，劉麗莉1，賀家亮1，任國艷1

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

為提高黃河鯉魚鱗膠原蛋白提取率，在4 ℃條件下，采用胃蛋白酶和0.5 mol/L乙酸溶液對其提取工藝進行研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計方法探索了提取時間、加酶量和料液比3 個因素對黃河鯉魚鱗酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）提取率的影響。結(jié)果表明，黃河鯉魚鱗PSC的最適提取工藝參數(shù)為提取時間60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL），在此條件下，PSC提取率達到（17.7±0.7）%。所提取的產(chǎn)品與酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC）有相似的電泳性質(zhì)和氨基酸組成，表明其可能與ASC具有相似的分子結(jié)構(gòu)。

黃河鯉魚鱗；膠原蛋白；提取工藝

膠原蛋白是脊椎動物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占動物總蛋白含量的30%[1]。膠原蛋白是一個龐大而復雜的蛋白質(zhì)家族，迄今為止研究人員已經(jīng)從眾多原料中分離并鑒定出21 種不同類型的膠原蛋白[2]。它們廣泛分布在動物的皮膚、骨骼、腱、血管和肌肉組織中，以維持組織和器官的穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整。特別是Ⅰ型膠原蛋白存在于所有脊椎動物的結(jié)締組織中[3]。魚鱗是生產(chǎn)膠原蛋白的重要原料，可作為哺乳動物原料的有效替代品。通常采用傳統(tǒng)的酸提取法制備酸溶性膠原蛋白，其提取率較低，而胃蛋白酶能夠打開膠原蛋白端肽區(qū)域的肽鏈，從而促進膠原蛋白的溶出[4]。

由于具有獨特的理化特性和功能特性，水產(chǎn)膠原蛋白的研究已經(jīng)廣受關(guān)注[5-9]。目前，對水產(chǎn)膠原蛋白的研究主要集中在海洋水產(chǎn)動物[3-6,9-16]，而對淡水魚類[17-20]膠原蛋白的研究較少，有關(guān)黃河鯉魚鱗膠原蛋白的提取工藝、理化特性、功能性質(zhì)、分子類型、組成結(jié)構(gòu)等有待研究。本實驗以黃河鯉魚鱗為原料，采用胃蛋白酶促溶提取工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用正交試驗設(shè)計對影響魚鱗膠原蛋白提取效率較大的影響因素進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃河鯉魚 河南三佳食品有限公司。

胃蛋白酶 美國Sigma公司；冰乙酸、檸檬酸、乙酸鈉、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸、氯胺-T等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722N型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Fs4111型電子分析天平 上海衡平儀器儀表廠；HR152型電熱恒溫水浴鍋 金壇市晶玻實驗儀器廠；氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 羥脯氨酸含量的測定

取魚鱗樣品約0.2 g于安培瓶中，加入6 mol/L的鹽酸2 mL，封口后于130 ℃水解4 h。利用NaOH溶液中和，定容至100 mL。取2 mL水解液加入1 mL氯胺試劑，搖勻，室溫條件下放置20 min，加入1 mL發(fā)色劑（溶解10 g對二甲胺基苯甲醛于35 mL 60%高氯酸溶液中，緩慢地加入65 mL異丙醇，并不斷攪動，制備液當天使用），充分混合，于60 ℃水浴加熱20 min，冷卻后在558 nm波長處測其吸光度，同時做空白實驗。配制不同質(zhì)量濃度羥脯氨酸溶液按照上述方法測定吸光度，制作標準曲線。魚鱗膠原蛋白提取率計算公式如下：

1.3.2 魚鱗的預處理

先酸后堿處理：稱取2.0 g魚鱗，按料液比1∶10（g/mL）加入1 mol/L的HCl溶液浸泡2 h，用蒸餾水清洗干凈。再按1∶10（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h去除雜蛋白。按1.3.1節(jié)方法測定魚鱗中羥脯氨酸的質(zhì)量，計算樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分數(shù)。

先堿后酸處理：稱取2.0 g魚鱗，按1∶10（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h去除雜蛋白，用蒸餾水清洗干凈。再按料液比1∶10（g/mL）的比例加入1 mol/L的HCl溶液浸泡2 h。按1.3.1節(jié)方法測定魚鱗中羥脯氨酸的質(zhì)量，計算樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分數(shù)（濕基）。

以處理后樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分數(shù)來表示雜蛋白脫除的效果，樣品中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)越高表明雜蛋白的脫除率越高。

1.3.3 魚鱗膠原蛋白提取單因素試驗

采用0.5 mol/L乙酸溶液提取魚鱗酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC），以提取ASC后的殘渣作為研究對象，采用胃蛋白酶輔助的方法進行胃蛋白酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）的提取。選擇提取時間（24、36、48、60、72 h）、加酶量（20、30、40、50、60 kU/g）和料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL））作為影響因素，計算PSC提取率。

1.3.4 魚鱗PSC提取正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取時間、加酶量和料液比為影響因素，各取3 個水平，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，以PSC提取率為指標，確定黃河鯉魚鱗PSC的最適提取工藝。試驗的因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used in the orthogonal array design

1.3.5 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照文獻[16]的方法并作適當?shù)男薷摹Ｊ褂么怪卑咫娪狙b置，分離膠質(zhì)量分數(shù)為7.5%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%。分離膠配方為：去離子水3.3 mL，30%丙烯酰胺1.5 mL，10% SDS 100 μL，10%過硫酸銨100 μL，Tris-HCl（1.5 mol/L，pH 8.8）2.5 mL；電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.3，含0.1% SDS）；樣品緩沖液為pH 8.8的的Tris-HCl緩沖液；染色液為0.25%考馬斯亮藍、甲醇、去離子水混合；脫色液為7.5%甲醇、5%冰乙酸混合液。

1.3.6 氨基酸組成分析

將ASC和PSC樣品分別用6 mol/L的HCl溶液于105 ℃水解24 h，采用氨基酸自動分析儀測定水解物的氨基酸組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿處理順序?qū)︳~鱗預處理效果的影響

先利用HCl溶液脫除魚鱗中的礦物質(zhì)，再用堿液對其進行處理后，魚鱗樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分數(shù)（濕基）為（31.3±0.6）%；而根據(jù)已報道的相關(guān)文獻中所采用的先堿液處理、再用HCl溶液處理的工藝對黃河鯉魚磷進行處理后，魚鱗樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分數(shù)（濕基）為（19.5±0.9）%?？梢?，先用鹽酸脫除魚鱗中的礦物質(zhì)、再用堿液處理更有利于魚鱗雜蛋白的脫除，該處理組與先堿處理后酸處理組相比，魚鱗樣品中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著提高（P＜0.01）。魚鱗中除膠原蛋白外，還含有其他種類蛋白質(zhì)，其中一些蛋白質(zhì)可以在酸性、堿性或較高溫度的水中溶出，因此，在提取魚鱗膠原蛋白或明膠之前，有必要對其進行適當?shù)奶幚硪蕴岣吣繕水a(chǎn)物的純度。根據(jù)相關(guān)的文獻報道，對魚鱗的前處理工藝基本是先采用一定料液比的NaOH溶液或NaCl溶液浸泡，以去除其中的雜蛋白，然后用一定料液比的酸溶液或乙二胺四乙酸溶液浸泡以脫除魚鱗中的礦物質(zhì)成分[16,18-19,21]。但是并沒有關(guān)于處理工藝對其雜蛋白脫除效率影響的報道，也沒有魚鱗雜蛋白脫除工藝優(yōu)化的研究報道。

實驗結(jié)果表明，魚鱗預處理流程對提高魚鱗樣品中膠原蛋白含量有顯著影響（P＜0.01），因為魚鱗在骨質(zhì)層，礦物質(zhì)與其中蛋白質(zhì)等有機成分相結(jié)合，不利于其中蛋白質(zhì)的溶出，而利用酸液脫除魚鱗中礦物質(zhì)后，魚鱗的骨質(zhì)層結(jié)構(gòu)變得較為松散，雜蛋白與堿液接觸更充分，因此脫除礦物質(zhì)后更有利于魚鱗中雜蛋白的溶出。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對魚鱗PSC提取率的影響

圖1 提取時間對PSC提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on collagen yield

在加酶量40 kU/g、料液比1∶10（g/mL）條件下改變提取時間，測定魚鱗PSC提取率。如圖1所示，魚鱗PSC提取率隨提取時間的延長而提高，當提取時間超過60 h以后，提取率隨提取時間的變化趨勢較緩慢，提取率無顯著變化（P＞0.05），因此選擇60 h為較優(yōu)提取時間。

2.2.2 加酶量對魚鱗PSC提取率的影響

圖2 加酶量對PSC提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on collagen yield

在提取時間60 h、料液比1∶10（g/mL）的條件下研究加酶量對魚鱗PSC提取率的影響。如圖2所示，在加酶量0～40 kU/g范圍內(nèi)，提取率隨加酶量的增大而迅速升高，繼續(xù)提高加酶量則對提PSC提取率沒有顯著影響（P＞0.05），因此選擇加酶量40 kU/g作為較優(yōu)水平。

2.2.3 料液比對魚鱗PSC提取率的影響

圖3 料液比對PSC提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of solvent to solid on collagen yield

在提取時間60 h、加酶量40 kU/g的條件下研究料液比對魚鱗PSC提取率的影響。如圖3所示，PSC提取率隨溶劑用量的增大呈增加趨勢，表明溶劑用量的增大有利于魚鱗中膠原蛋白的溶出。當料液比達到1∶10（g/mL）之后時，PSC提取率沒有顯著變化（P＞0.05），考慮實際生產(chǎn)的需要，選擇1∶10（g/mL）作為較優(yōu)水平。

2.3 黃河鯉魚鱗PSC提取工藝優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇提取時間、加酶量和料液比3 個因素按L9（34）正交設(shè)計表（表1）進行正交試驗，正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析如表2所示。試驗結(jié)果的極差分析表明，對黃河鯉魚鱗酶促溶性PSC提取率影響最大的是提取時間，其次是加酶量，料液比的影響最小。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

如表3方差分析所示，可以看出提取時間和加酶量對黃河鯉魚鱗PSC提取率有顯著影響（P＜0.05），而料液比因素在試驗中對魚鱗PSC的提取率沒有顯著影響，對試驗因素各水平進行最小顯著差數(shù)法多重比較，結(jié)果表明提取時間和加酶量的1水平與2、3水平存在顯著差異，2、3水平之間沒有顯著差異，而料液比各水平間均沒有顯著差異。根據(jù)試驗結(jié)果的極差分析（表2），黃河鯉魚鱗PSC提取率最優(yōu)水平組合為A3B3C3，結(jié)合試驗結(jié)果的方差分析，考慮到實際生產(chǎn)的方便，可修正黃河鯉魚鱗PSC提取工藝最優(yōu)組合為A2B2C2，即提取時間60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

在修正過的最優(yōu)工藝條件下進行驗證實驗，重復3 次，其結(jié)果為黃河鯉魚鱗P S C提取率為（17.7±0.7）%，因此，該工藝參數(shù)可以應用于黃河鯉魚鱗PSC的提取。

2.4 黃河鯉魚鱗PSC的SDS-PAGE分析

圖4 黃河鯉魚鱗膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of collagens fromCyprinus carpio haematopterusscale

圖4中α1-帶的強度大約是α2-帶的2倍，表明黃河鯉魚鱗膠原蛋白的分子可能為兩 條α1-鏈和一條α2-鏈構(gòu)成，或者由α1-鏈、α2-鏈和α3-鏈各一條構(gòu)成，可以看出，黃河鯉魚鱗PSC 屬于Ⅰ型膠原。這與許多魚類膠原蛋白如鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）[20]皮膠原、比目魚（Paralichthys olivaceus）[22]皮膠原、鯉魚（Cyprinus carpio）[23]皮和鱗膠原等類似。

由圖4可知，黃河鯉魚鱗PSC與ASC有相似的電泳圖譜，但是PSC分子中α1-鏈和α2-鏈的分子質(zhì)量較ASC要低，說明PSC與ASC的主體結(jié)構(gòu)一致，但PSC只含有膠原的3 股螺旋主體結(jié)構(gòu)，胃蛋白酶能夠斷開端肽區(qū)的交聯(lián)分子，但不能破壞3 股螺旋的完整結(jié)構(gòu)，因此，對于酸法難以提取的膠原蛋白，利用胃蛋白酶處理可以有效提高膠原蛋白提取率。

2.5 黃河鯉魚鱗氨基酸組成分析

表4 黃河鯉魚鱗膠原蛋白氨基酸構(gòu)成Table 4 Amino acid composition of collagens fromCyprinus carpio haematopterus殘基數(shù)/1 000 個

如表4所示，黃河鯉魚鱗PSC的氨基酸組成與其他膠原蛋白類似，其中所含Gly比例最高（約為總氨基酸數(shù)量的1/3），而Tyr、His、Phe、Ile和Met所占比例較低。相對于Ⅰ型膠原蛋白而言，黃河鯉魚鱗PSC中Met和Phe所占比例較高，而膠原蛋白的特征氨基酸Hyp的比例較低。其亞氨基酸（Hpy和Pro）殘基所占比例分別為18.2%和19.8%，低于豬皮膠原蛋白的22%和Ⅰ型膠原蛋白的21.5%[18]，但是與一些魚皮和魚鱗的膠原蛋白比較接近[18,24]。黃河鯉魚鱗PSC與ASC在氨基酸組成上比較接近，與其電泳圖譜一致，表明黃河鯉魚鱗PSC與ASC可能具有相似的理化特性。

3 結(jié) 論

先脫除黃河鯉魚鱗中礦物質(zhì)，再采用堿液處理，可以顯著提高魚鱗樣品中膠原蛋白的含量，即脫除礦物質(zhì)的處理更有利于魚鱗樣品中非膠原蛋白成分的脫除。所得產(chǎn)品與傳統(tǒng)酸性介質(zhì)提取的酸溶性膠原蛋白具有一致的分子結(jié)構(gòu)和組成，胃蛋白酶可以促進黃河鯉魚鱗中難溶性膠原蛋白溶出，提取時間、加酶量和料液比是影響黃河鯉魚鱗PSC提取率的重要因素，通過單因素試驗和正交試驗確定黃河鯉魚鱗PSC的提取工藝參數(shù)為提取時間60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL），提取率可達（17.7±0.7）%。胃蛋白酶不能破壞黃河鯉魚鱗膠原蛋白的主體結(jié)構(gòu)，所得PSC與ASC具有相似的電泳性質(zhì)和氨基酸組成，電泳圖譜表明黃河鯉魚鱗PSC與ASC一樣為典型的Ⅰ型膠原蛋白。

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Orthogonal Array Design for the Optimization of Pepsin Soluble Collagen Extraction from Cyprinus carpio haematopterusScale

XIAO Feng1,2, ZHU Wenxue1,*, KANG Huaibin1, LIU Lili1, HE Jialiang1, REN Guoyan1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Pepsin and 0.5 mol/L acetic acid were used to enhance the extraction of collagen from Cyprinus carpio haematopterus scale at 4 ℃. Using combination of single factor experiments and orthogonal array design, the effect of extraction time, enzyme concentration and ratio of solid to solvent on the yield of pepsin soluble collagen (PSC) from C. haematopterus scale were explored. The results showed that the optimal conditions for PSC extraction were determined as follows: extraction time, 60 h; enzyme concentration, 40 kU/g; and ratio of solid to solvent, 1:10 (g/mL). The yield of PSC under these conditions was (17.7 ± 0.7)%. The PSC had electrophoretic properties amino acid composition similar to those of acid soluble collagen (ASC), suggesting similarity beween their molecular structures.

Cyprinus carpio haematopterus scale; collagen; extraction process

TS254.9

A

1002-6630（2015）12-0060-05

10.7506/spkx1002-6630-201512011

2014-10-11

肖楓（1979—），男，講師，博士，研究方向為水產(chǎn)品綜合利用。E-mail：xfeng@haust.edu.cn

*通信作者：朱文學（1967—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品干燥和農(nóng)產(chǎn)品功能性成分分離、提取及活性。

E-mail：zwx@mail.haust.edu.cn