豬瘟活疫苗的品質(zhì)提升研究

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心河北保定071000）

豬瘟活疫苗的品質(zhì)提升研究

梁武1,2,何平有1,2,韓佳麗1,2,楊保收1,2，朱秀同1,2

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心河北保定071000）

為了提高豬瘟活疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用改良保護(hù)劑分別與豬瘟組織毒和豬瘟細(xì)胞毒進(jìn)行凍干試驗(yàn)，成功試制2種豬瘟活疫苗。試制的2種豬瘟活疫苗，性狀和溶解情況良好，室溫保存2 d和溶解后室溫放置4 h對(duì)產(chǎn)品效價(jià)變化不明顯，均達(dá)到規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)要求。

豬瘟活疫苗；品質(zhì)；提升

豬瘟活疫苗活疫苗按規(guī)程工藝生產(chǎn)產(chǎn)品出現(xiàn)溶解狀態(tài)不佳、長(zhǎng)途運(yùn)輸品質(zhì)下降，我公司經(jīng)過(guò)技術(shù)改良取得較好效果，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料

1.1 毒種

豬瘟病毒兔化弱毒株（C株）由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定并提供，瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司結(jié)合優(yōu)良的原材料生產(chǎn)，經(jīng)全面鑒定為合格，置于-70℃保存供疫苗生產(chǎn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用營(yíng)養(yǎng)良好，體重1.5～3 kg家兔。購(gòu)入后，家兔應(yīng)隔離飼養(yǎng)觀察30 d以上。家兔接種前，至少應(yīng)測(cè)溫觀察5 d，每日上、下午各測(cè)溫1次。選用體溫正常、體溫波動(dòng)小于0.5℃的家兔。

1.3 凍干保護(hù)劑

凍干脫脂乳購(gòu)自新西蘭；多聚蛋白胨購(gòu)自日本株式會(huì)社；蔗糖、吐溫-80等購(gòu)自北京益利公司。

1.4 其他試劑與設(shè)備

MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京愛(ài)德仕公司；豬瘟專用新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司。

2 方法

2.1 半成品制備

2.1.1 豬瘟病毒組織毒制備按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》（2000年版）以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》[1]要求接種健康家兔收獲脾淋組織制備半成品。

2.1.2 豬瘟細(xì)胞毒制備豬瘟細(xì)胞毒接種易感ST細(xì)胞，收獲培養(yǎng)物，制備細(xì)胞毒半成品。

2.2 保護(hù)劑的配制

2.2.1 牛奶脫脂乳保護(hù)劑配制按照《規(guī)程》附錄426頁(yè)所述方法進(jìn)行配制，經(jīng)121℃滅菌15 min備用。

2.2.2 改良保護(hù)劑配制[2]將蔗糖、多聚蛋白胨、吐溫-80和脫脂乳等按照一定比例配制而成，制備3批保護(hù)劑，經(jīng)除菌后備用。

2.3 疫苗配制

2.3.1 組織毒疫苗的配制[1]在無(wú)菌操作下剔除脂肪組織。將檢驗(yàn)合格的制苗組織稱重、剪碎，然后加入適量改良保護(hù)劑混合4～8℃恒溫研磨并控制產(chǎn)品粒徑在0.2 μm，濾過(guò)扣除沉渣量，再按實(shí)際組織量補(bǔ)足剩余保護(hù)劑，進(jìn)行定量分裝凍干。并設(shè)立原工藝疫苗（《規(guī)程》）對(duì)照。

2.3.2 細(xì)胞毒疫苗的配制將檢驗(yàn)合格的豬瘟病毒細(xì)胞毒病毒液混合于同一無(wú)菌容器內(nèi)，按照適量比例添加改良保護(hù)劑，充分混合后進(jìn)行定量分裝與凍干。并設(shè)立原工藝疫苗對(duì)照。

2.4 疫苗檢驗(yàn)

2.4.1 性狀觀察凍干品是否為海綿狀疏松團(tuán)塊物質(zhì)性狀。

2.4.2 溶解性加入相應(yīng)疫苗稀釋液測(cè)定其完全溶解的時(shí)間并觀察溶解后2 h物理狀態(tài)是否改變（不溶物或沉淀）。

2.4.3 環(huán)境因素對(duì)疫苗的影響 測(cè)定-15℃放置1年、室溫（25℃）放置2 d以及溶解后室溫放置4 h產(chǎn)品的效價(jià)。

2.4.4 其它檢驗(yàn)按照原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行其余各項(xiàng)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 3批疫苗的性狀和溶解情況

3.1.1 性狀結(jié)果（如圖1～2）。從圖中可以看出，豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源），物理性狀良好，均為海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離。

圖1 豬瘟活疫苗（兔源）左2：改良配方組；右2：對(duì)照

圖2 豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）左2：改良配方組；右2：對(duì)照

3.1.2 溶解情況從表1可以看出，改良保護(hù)劑組均能有效地改善豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）的溶解狀態(tài)，溶解后無(wú)沉淀或漂浮物，而對(duì)照品均有不同程度的沉淀，豬瘟活疫苗（兔源）對(duì)照品還有漂浮物。

表1 豬瘟活疫苗溶解情況比較

3.2 環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)品效價(jià)的影響

從表2可以看出改良保護(hù)劑的豬瘟活疫苗（兔源）、豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）室溫放置2 d；溶解后能在室溫放置4 h產(chǎn)品滴度均不下降，而對(duì)照品均有不同程度的下降。

表2 環(huán)境對(duì)豬瘟活疫苗效價(jià)的影響

3.3 其它檢驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

3批豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、剩余水分和真空度檢驗(yàn)均符合規(guī)程要求。

表3 3批活疫苗的檢測(cè)結(jié)果

4 分析與討論

4.1 產(chǎn)品溶解性[3]

產(chǎn)品的溶解性直接影響產(chǎn)品應(yīng)用方便程度和應(yīng)用效果。在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用研究中我們發(fā)現(xiàn)豬瘟組織苗（脾淋苗）在使用常常出現(xiàn)情況：溶解速度慢常常需要幾分鐘，溶解以后出現(xiàn)有漂浮物和沉淀的情況。經(jīng)過(guò)我們觀察，初步將漂浮物分為二類，一類是不相容的油滴，另一類為絮狀結(jié)締組織。針對(duì)油狀漂浮物，一方面采用搗碎前的脂肪組織、結(jié)締組織分離，另一方面，采用冷處理分離技術(shù)有效分離油狀物和結(jié)締組織。出現(xiàn)沉淀和溶解速度慢，這可能與組織顆粒大，凍干品過(guò)于致密相關(guān)，病毒提取工藝不佳，在本研究中我們一方面控制搗碎顆粒大小0.2 μm以內(nèi)，另一方面采用增溶劑保證病毒顆粒充分溶出，嚴(yán)禁大顆粒濾過(guò)。而豬瘟細(xì)胞苗溶解的主要問(wèn)題是有沉淀，這可能與抗原液的pH值相關(guān)，研究中經(jīng)過(guò)pH調(diào)節(jié)和增溶劑等的調(diào)整，改進(jìn)產(chǎn)品未見(jiàn)溶解后有沉淀。

4.2 產(chǎn)品的保存與使用

產(chǎn)品嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行保藏和使用是可以保證產(chǎn)品質(zhì)量的。但是我們?cè)谶\(yùn)輸、保存和使用中，常常保存溫度略有上升達(dá)不到相關(guān)要求，造成產(chǎn)品質(zhì)量下降。這種產(chǎn)品質(zhì)量可能由于產(chǎn)品保存溫度上升，蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚、氧化反應(yīng)和水解反應(yīng)等[4]作用下，導(dǎo)致產(chǎn)品中病毒蛋白部分失活，從而使得產(chǎn)品質(zhì)量下降。而這種溫度升高，經(jīng)過(guò)估算相當(dāng)于室溫放置1 d左右，溶解后室溫放置2 h以內(nèi)。經(jīng)抗氧化成分和蛋白增溶劑的添加，室溫放置2 d或室溫溶解4 h后檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量仍合格，說(shuō)明該方法在外界環(huán)境作用下有一定維持產(chǎn)品質(zhì)量的作用，一定程度上滿足了養(yǎng)殖生產(chǎn)的實(shí)際需要。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)成功地研制出一種凍干保護(hù)劑。應(yīng)用該保護(hù)劑中試生產(chǎn)的3批豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源），全部通過(guò)無(wú)菌、支原體、鑒別、安全、效力、剩余水分、真空度等各項(xiàng)檢驗(yàn)，均符合《規(guī)程》要求。

中試生產(chǎn)的3批豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）顯示出良好的性狀和溶解性能，對(duì)外界因素有一定抵抗力，室溫放置2 d或室溫溶解4 h對(duì)產(chǎn)品效價(jià)影響不明顯，均達(dá)到規(guī)程要求。■（編輯：趙曉松）

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[S],2000.

[2] 朱良全.豬瘟兔化弱毒（C株）和雞馬立克火雞皰疹病毒（HVT）病毒保護(hù)劑的研究 [D].中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學(xué)位論文, 2004(7).

[3] L.拉赫曼,H.A.利伯曼,J.L.卡尼希.工業(yè)藥劑學(xué)的理論與實(shí)踐[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1984.

[4] 華澤釗.冷凍干燥新技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2005.

Study on Improving the Quality of Live Vaccines for Swine

LiangWu1,2,He Pingyou1,2,Han Jiali1,2,Yang Baoshou1,2,Zhu Xiutong1,2
(1.Ringpu(Baoding)Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.,Baoding Hebei,071000;
2.Hebei Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biotechnology,Baoding Hebei,071000)

Applied the modified stabliliser with rabbit origin swine fever virus or tissue culture origin swine fever virus on lyophilisation tests to improving the quality of the live vaccine for swine,2 different swine fever live vaccines had been trial produced,all shape and properties and dissolution characters were passed the test. Placing these vaccine in room-temperature (RT)for 2 days,and then reconstitute it in RT for 4h,the titers were changed insignificantly and passed all procedure standards.

swine fever，live vaccine,quality,improving

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.09.038

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)勵(lì)性后補(bǔ)助項(xiàng)目（15926617H）。

梁武（1968-），男，天津人，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸用生物制品學(xué)研究工作E-mail:sales@ringpu.com。