大鼠血管壁中膜平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

敖 鋒 ，張自力 ，宋 健

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

大鼠血管壁中膜平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

敖 鋒1，2，張自力1，宋 健2

目的 探討一種方便、快捷、大量原代培養(yǎng)大鼠血管壁中膜平滑肌細(xì)胞的方法，為心血管疾病的體外研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料。方法 利用改良的組織貼塊法進(jìn)行血管壁中膜平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用免疫熒光染色鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞。結(jié)果 改良的組織貼塊法成功培養(yǎng)出大鼠血管壁中膜平滑肌細(xì)胞，3 d～5 d可見細(xì)胞爬出，7 d～9 d即可傳代。鏡下見細(xì)胞以長梭形為主，呈典型“峰-谷”樣生長，免疫熒光染色鑒定陽性細(xì)胞率在95%以上。結(jié)論 本研究介紹的改良組織貼塊法技術(shù)成熟，具有操作簡單、方便等優(yōu)點(diǎn)，使用該法不僅可以獲得純度高、活性好的血管中膜平滑肌細(xì)胞，而且縮短了培養(yǎng)周期。

血管壁；中膜；平滑肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)

血管壁中膜平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)和維持血管張力的重要成分之一，而SMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換、遷移、異常增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)所引起的內(nèi)膜增厚是高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等心血管疾病的核心病理過程[1-2]。因此，研究中膜SMC增殖、遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及尋找動脈粥樣硬化等疾病的分子治療靶點(diǎn)是當(dāng)前心血管界的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3]，而SMC的原代培養(yǎng)為進(jìn)行心血管疾病的分子生物學(xué)機(jī)制體外研究、相關(guān)藥理研究提供了有利的實(shí)驗(yàn)材料。筆者在對國內(nèi)外同行研究深入分析的基礎(chǔ)上對傳統(tǒng)SMC培養(yǎng)方法組織貼塊法進(jìn)行改進(jìn)，通過反復(fù)實(shí)踐摸索建立出穩(wěn)定、快捷、方便、高效的大鼠中膜SMC體外培養(yǎng)模型，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對其鑒定，純度在95%以上?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康SD雌性大鼠，(2～3)月齡，體重150 g～200 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑 DMEM/F-12液體培養(yǎng)基(Gibco公司)、青霉素(Amresco公司)、鏈霉素(Amresco公司)、Ⅱ型膠原酶(Worthington Biochemical公司)、β-巰基乙醇(Sigma公司)、谷氨酰胺(Thermo公司)、炭吸附特級胎牛血清(Biological Industries公司)、兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體(Abcam公司)、Hoechst(Sigma公司)、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Beyotime公司)等均通過商品化途徑購置。

1.3 SMC的原代培養(yǎng) 按0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥鈉，待大鼠麻醉后，無菌條件下迅速分離大鼠主動脈，置于盛有無菌D-Hank’s液(4 ℃預(yù)冷)的培養(yǎng)皿中清洗3次，清洗過程中同時剔除血管表面的脂肪組織、結(jié)締組織以及血凝塊。將主動脈轉(zhuǎn)移至另一潔凈盛有無菌D-Hank’s液(4℃預(yù)冷)的培養(yǎng)皿中，眼科剪剪開血管，無菌棉簽沿血管縱軸來回擦拭主動脈內(nèi)膜3次，以去除血管內(nèi)皮細(xì)胞。從D-Hank’s液中取出主動脈，放入含有1 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶的EP管中，置于37℃水平搖床中消化12 min。顯微鑷小心撕下血管中膜，置入盛有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用顯微剪將中膜剪成1 mm×1 mm大小碎片，均勻擺置鋪平于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底并在瓶內(nèi)側(cè)壁加入3 mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶側(cè)放豎立(見圖1a)于37℃恒溫、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置1 h，然后翻轉(zhuǎn)T25培養(yǎng)瓶使瓶底朝上(見圖1b)再靜置1 h～1.5 h。待觀察到組織塊稍變干與培養(yǎng)瓶底黏附后，緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放(見圖1c)，絕對靜置培養(yǎng)箱內(nèi)3 d～5 d，期間禁止震蕩或移動培養(yǎng)皿，以防貼壁的組織碎片脫落。5 d后每日用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

圖1 T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶擺放示意圖

1.4 SMC的傳代培養(yǎng)及純化 當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到亞融合狀態(tài)(約80%融合)時即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，37℃預(yù)熱的無菌D-Hank’s液清洗細(xì)胞表面3次，清洗過程中晃動培養(yǎng)瓶以除去組織塊和殘余的血清。吸盡D-Hank’s液后，在細(xì)胞表面均勻地加入0.125%胰酶和0.02%EDTA的混合液600 μL，37℃條件下消化3 min。待顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞收縮變圓從皿底脫落后，立即加入1.5 mL完全培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，離心后按照1∶3的比例分瓶培養(yǎng)。

由于培養(yǎng)的細(xì)胞中可能含有成纖維細(xì)胞混雜生長，因此可采用差異貼壁法純化中膜SMC[4]。即在傳代時將細(xì)胞懸液靜置(15～25)min，使成纖維細(xì)胞貼壁，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至另一個培養(yǎng)瓶中，再次靜置貼壁，重復(fù)上述步驟(2～3)次即可獲得純化的平滑肌細(xì)胞。

1.5 SMC的鑒定 將傳代時制備好的細(xì)胞爬片置于24孔板內(nèi)，0.1 mol/L PBS浸洗細(xì)胞爬片5 min×3次；然后4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS浸洗5 min×3次。0.1%Triton X-100室溫孵育10 min，PBS浸洗細(xì)胞爬片5 min×3次。5%BSA室溫封閉30 min后吸盡封閉液，按照1∶50比例稀釋一抗(兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體)，每張爬片滴加50 μL一抗，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。次日，PBS浸洗細(xì)胞爬片5 min×3次，按照1∶200比例稀釋帶熒光的二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)，濕盒內(nèi)避光條件下室溫孵育2 h。每張爬片滴加20 μL Hoechst染核2 min，PBS浸洗后甘油封片，熒光顯微鏡下采集圖像。陽性染色以胞質(zhì)出現(xiàn)綠色為標(biāo)準(zhǔn)，選擇著色均勻的區(qū)域，在熒光顯微鏡40倍視野下計(jì)數(shù)綠色細(xì)胞占該視野細(xì)胞總數(shù)的百分比。每張切片選擇6個視野，每組取6張切片，計(jì)算平均值。

2 結(jié) 果

2.1 SMC體外培養(yǎng)生長狀況 改良的組織貼塊法成功培養(yǎng)出大鼠血管壁中膜SMC，3 d～5 d見細(xì)胞從組織塊邊緣遷移萌出，細(xì)胞體積小，形態(tài)不一，大部分呈長梭形，少量呈三角形或不規(guī)則形，折光性強(qiáng)，胞質(zhì)豐富。約7 d～9 d細(xì)胞生長致密成層，融合成片，呈典型“峰-谷”樣生長狀態(tài)時即可傳代(見圖2)。

a：原代培養(yǎng)第4天見組織塊旁 b：原代培養(yǎng)第4天見爬出的細(xì)胞大部分呈 c：原代培養(yǎng)第7天見細(xì)胞呈典型 少許細(xì)胞爬出(×10) 長梭形，折光性強(qiáng)，胞質(zhì)豐富(×20) “峰-谷”樣生長(×40)

2.2 SMC的鑒定 培養(yǎng)的第3代SMC經(jīng)平滑肌特異性蛋白-平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain，SM MHC)免疫化學(xué)染色后，正置顯微鏡下見SM MHC沿細(xì)胞縱軸呈肌絲狀整齊排列于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)呈綠色，細(xì)胞核呈卵圓形居中，陽性細(xì)胞率在95%以上(見圖3)，這表明本方法分離培養(yǎng)的SMC純度高。

a：綠色熒光表示SM MHC呈肌絲狀 b：藍(lán)色熒光表示Hoechst染核 c：a和b的融合圖整齊排列于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(FITC標(biāo)記)

3 討 論

血管壁中膜SMC原代培養(yǎng)的方法主要有酶消化法和組織貼塊法，酶消化法由于受中膜組織需求量大、得率低、消化步驟多、酶作用時間難以掌控、污染概率高等因素的影響[5]，限制了其廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)廣泛應(yīng)用的是組織貼塊法，組織貼塊法具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡單、細(xì)胞活性好、得率高等優(yōu)點(diǎn)，不足之處是培養(yǎng)周期長。本研究在傳統(tǒng)組織貼塊法基礎(chǔ)上通過反復(fù)實(shí)踐，并借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過改良不僅縮短了培養(yǎng)周期，而且獲得純度較高的SMC?，F(xiàn)就關(guān)鍵環(huán)節(jié)做以討論。

3.1 動物及麻醉方式的選擇 眾所周知，年幼大鼠的組織塊具有更強(qiáng)的增殖潛能，原代培養(yǎng)成活率更高，但體重太小的大鼠取材困難且細(xì)胞得量少[6]。經(jīng)過反復(fù)摸索，本課題組認(rèn)為選取(2～3)月齡、體重(150～200)g大鼠最為適宜，這樣既方便操作，又保證細(xì)胞未過于老化。傳統(tǒng)方法采用頸椎脫臼處死大鼠，這可能導(dǎo)致大鼠處死過久尚未完成取材。本研究采用麻醉動物的方法不僅減少了動物的痛苦，而且保證了組織的活性，減少組織變性，從而確保細(xì)胞活力。

3.2 取材要迅速并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作 加強(qiáng)取材訓(xùn)練，盡量在30 min內(nèi)完成從取材到貼壁的全過程，減少細(xì)胞活性的降低。麻醉后的大鼠用70%酒精消毒皮膚，剪開皮膚后更換一套消毒的器械，打開胸腔后再更換一套；獲取大鼠主動脈時，采用消毒后紗布保護(hù)肺，避免損傷肺引起污染。

3.3 徹底去除血管內(nèi)、外膜 用棉簽擦拭內(nèi)膜避免內(nèi)皮細(xì)胞的污染，分離中膜，去掉外膜，避免了外膜成纖維細(xì)胞的污染。同時在傳代時采用差異貼壁法進(jìn)一步純化了中膜SMC，保證細(xì)胞的高純度。

3.4 組織碎片的選取及翻瓶方法 組織碎片一定要“剪”而不能“撕”，剪切時要輕柔，大小以1 mm×1 mm為最佳。組織碎片過小，操作頻繁且損傷細(xì)胞較多，不利于其生長；組織碎片過大，SMC因營養(yǎng)攝取不足而遷出困難。組織碎片移入T25培養(yǎng)瓶后，文獻(xiàn)多報(bào)道將有組織碎片的培養(yǎng)瓶底面朝上靜置(2～3)h后再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織碎片與培養(yǎng)基接觸。本課題組在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用這種方法(2～3)h后組織碎片周圍仍然很潮濕，組織碎片不能很好貼于瓶底，翻瓶后有多數(shù)組織碎片飄起。于是，改進(jìn)為將培養(yǎng)瓶側(cè)放豎立于培養(yǎng)箱內(nèi)1 h，利用液體重力作用使瓶底和組織碎片周圍的液體流至瓶底，然后翻轉(zhuǎn)T25培養(yǎng)瓶使瓶底朝上再靜置(1～1.5)h后，緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放。這樣不僅減少翻瓶的等待時間(時間太長組織會干涸)，而且飄起的組織碎片極少。因此，組織碎片能夠盡早接觸培養(yǎng)基，有利于細(xì)胞更早遷出[7]。

本研究對傳統(tǒng)的中膜SMC原代培養(yǎng)進(jìn)行了改良，獲得了較為理想的結(jié)果，該方法能為動脈粥樣硬化等心血管疾病的病因、病理生理機(jī)制及防治研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料。

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(本文編輯 王雅潔)

Primary Culture and Identification of the Smooth Muscle Cells from the Medial of Vascular wall in Rats

Ao Feng，Zhang Zili，Song Jian Renmin Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China；Wuhan University School of Medicine，Wuhan 430071，Hubei，China

Corresponding Author：Song Jian(Wuhan University School of Medicine，Wuhan 430071，Hubei，China)

Objective To investigate the primary culture and identification of the smooth muscle cells (SMC) from the medial of vascular wall in rats.Methods SMC from the medial of vascular wall were cultured by modified tissue culture.The cellular morphology was observed under inverted phase contrast microscope.SMC were isolated and identified with immunofluorescence.Results SMC were isolated successfully and cultured.The cells had a typical peak-valley like growth，and showed fusiform.The positive rate of cells identified with immunofluorescence were more than 95%. Conclusion The modified tissue culture can isolate and cultivate SMC with high purity and good activity under in vitro conditions with simple，reliable method.

vascular wall； medial； smooth muscle cells； primary culture

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助(No.81170134)

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院( 湖北十堰 442000)，E-mail：aofeng19841112@163.com；2.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系

宋健，E-mail：songwhu@yahoo.com.cn

R54 R285

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.007

1672-1349(2015)17-1937-03

2015-07-01)