微粉化雙黃樸水凝膠貼劑的制備與體外透皮研究*

何金鳳，胡曦丹，張文靜，萬思慧，王卓

微粉化雙黃樸水凝膠貼劑的制備與體外透皮研究*

何金鳳1，2，胡曦丹3，張文靜2，萬思慧3，王卓2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230031；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；3.中國藥科大學(xué)，南京 211198)

目的 研制微粉化雙黃樸水凝膠貼劑，并觀察其體外釋藥性能及透皮吸收特點(diǎn)。方法 以水溶性高分子材料為輔料制備微粉化雙黃樸水凝膠貼劑；高效液相色譜法測(cè)定小檗堿的經(jīng)皮吸收量，按《中華人民共和國藥典》2010年版進(jìn)行體外釋放度測(cè)定，采用改良的Franz擴(kuò)散池法研究水凝膠貼劑的經(jīng)皮吸收特點(diǎn)。結(jié)果 水凝膠貼劑含藥量穩(wěn)定，體外釋藥符合Higuchi分布方程，水凝膠貼劑中的小檗堿在12 h內(nèi)透皮為零級(jí)過程，釋放速率是7.934 μg·(cm2)-1·h1/2，透皮速率為0.571 μg·(cm2)-1·h-1。結(jié)論 微粉化雙黃樸水凝膠貼劑為一種新型控釋型經(jīng)皮給藥制劑。

微粉化雙黃樸；水凝膠貼劑；小檗堿；釋放，體外；透皮

如意金黃散又名金黃膏、金黃散、金黃如意散，系經(jīng)典名方，始見于明代陳實(shí)功編寫的《外科正宗》[1]。

1 動(dòng)物、試藥與儀器

1.1 動(dòng)物 無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級(jí)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠，體質(zhì)量(200±10) g，雌雄均可，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0003，使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2012-0003，動(dòng)物飼養(yǎng)于無菌環(huán)境。

1.2 試藥 本實(shí)驗(yàn)所用生藥材由安徽中醫(yī)藥大學(xué)全山叢教授鑒定，大黃為蓼科植物藥用大黃(Rheumoj-flcinaleBaill.)的干燥根和根莖，黃柏為蕓香科植物黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)的樹皮，厚樸為木蘭科植物厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.etWils.)的干燥干皮、根皮及枝皮。小檗堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-200911)；厚樸酚對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110729-200412)；大黃素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110756-200110)；黃柏和厚樸藥材(上海蔡同德堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：11071025，11071023)，大黃藥材(上海華鷹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：HY2009030418)；甲醇為色譜純，水為純化水。

1.3 儀器 LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)，LC-solution色譜工作站，紫外檢測(cè)器；DL-720A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；JA1003電子天平(感量：1 mg，上海精科天美貿(mào)易有限公司)；AG285電子天平(感量：0.01 mg，METTLER TDLEDO)；透皮擴(kuò)散儀(上海長海醫(yī)院自制)；101-2型電熱鼓風(fēng)箱(上海市上海縣第二鼓風(fēng)廠)；JGM-T100氣流粉碎機(jī)(上海知萌生物醫(yī)藥科技有限公司)；PULVERISETTE 7球磨機(jī)(上海知萌生物醫(yī)藥科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 微粉化雙黃樸水凝膠貼劑的制備

2.1.1 處方 黃柏微粉2.5 g，厚樸微粉1 g，大黃微粉2.5 g，聚丙烯酸鈉3 g，卡波姆2 g，羧甲基纖維素鈉1 g，甘油35 g，高嶺土3 g，甘羥鋁0.3 g，酒石酸0.6 g，氮酮和1-甲基-2-吡咯烷酮各0.3 g。

2.1.2 大黃、黃柏及厚樸微粉的制備 在溫度15 ℃，相對(duì)濕度50%的條件下，使用氣流粉碎機(jī)，干法粉碎1 h，粉碎后粒徑約10 μm，然后在環(huán)境溫度25 ℃，相對(duì)濕度40%條件下，使用球磨機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r·min-1干法研磨6次，每次研磨5 min，研磨后粒徑：大黃5.3 μm，黃柏2.9 μm，厚樸7.2 μm。

2.1.3 制備工藝 按處方量稱取聚丙烯酸鈉、卡波姆及羧甲基纖維素鈉，加入甘油混合均勻后，加入水200 g使其充分溶脹得Ⅰ相，另稱取高嶺土、酒石酸、甘羥鋁、氮酮及1-甲基-2-吡咯烷酮加適量純化水溶解得Ⅱ相，將稱好的微粉黃柏、大黃及厚樸少量多次加入到70 g水中，邊加邊攪拌得Ⅲ相，將Ⅱ相加到Ⅰ相，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蟮芒粝?，將Ⅲ相加到Ⅳ相，攪拌均勻，放?0 ℃烘箱烘30 min，涂布于背襯材料無紡布上，烘干，覆蓋聚乙烯薄膜，密封包裝。

瑞舒伐他汀聯(lián)合替羅非班對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征并發(fā)糖尿病患者PCI術(shù)后血清炎癥因子水平和腎功能的影響…………………………………………………… 楊建軍等（5）：679

2.2 微粉化雙黃樸水凝膠貼劑含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACE.5C18-AR 柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(B)-0.2%的三乙胺水溶液(A)(磷酸調(diào)pH值5.0)，梯度洗脫(0～5 min，50%B→75%B；～15min，75%B；～23 min，75%B→80%B；～30 min，50%B)；流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長λ=345 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取小檗堿對(duì)照品14.60 mg、大黃素對(duì)照品2.56 mg及厚樸酚對(duì)照品7.30 mg，加甲醇5 mL分別配制成濃度為2.92 mg·mL-1小檗堿儲(chǔ)備液、512 μg·mL-1大黃素儲(chǔ)備液、1.46 mg·mL-1厚樸酚儲(chǔ)備液。分別精密量取3種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成小檗堿濃度為292 μg·mL-1，大黃素濃度為256 μg·mL-1，厚樸酚濃度為292 μg·mL-1的混合儲(chǔ)備液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品1片，規(guī)格為30 cm×21 cm，取面積3 cm×3 cm大小，除去防黏層，將其剪碎置于500 mL燒杯中，加入95%乙醇200 mL浸泡12 h后，超聲2 h，提取3次，提取完全后，取提取液，用內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 量取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及純甲醇溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。由圖1可知，小檗堿的保留時(shí)間為6.2 min，厚樸酚的保留時(shí)間為17.2 min，大黃素的保留時(shí)間為22.8 min。表明該方法專屬性好。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取小檗堿對(duì)照品溶液適量，用甲醇溶解稀釋成一系列濃度為0.292，2.92，29.2，73，146，292 μg·mL-1的小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以樣品峰面積(Y)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，小檗堿的回歸方程是：Y=2.3×105C-0.319(R2=0.999 8)，表明小檗堿在0.292～292.000 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A.甲醇(294 nm)，B.甲醇(345 nm)，C.對(duì)照品(294 nm)，D.對(duì)照品(345 nm)；1.小檗堿，2.厚樸酚，3.大黃素

圖1 3種成分的HPLC色譜圖

A. methanol(294 nm)；B. methanol (345 nm)；C.control substance (294 nm);D.control substance (345 nm);1.berberine;2. magnolol；3.emodin

Fig.1 HPLC chromatograms of three ingredients

2.2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 量取小檗堿對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=0.25%(n=6)。

2.2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 量取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10及12 h測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=1.23%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下制備微粉化雙黃樸水凝膠貼劑6份，規(guī)格為30 cm×21 cm。各取面積3 cm×3 cm大小，除去防黏層，將其剪碎置于500 mL燒杯中，加入95%乙醇200 mL浸泡12 h后，超聲2 h，提取3次。提取完全后，取提取液，用內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜濾過。取濾液，采用HPLC法測(cè)定小檗堿的含量。測(cè)定結(jié)果分別是0.348，0.336，0.321，0.362，0.358，0.369 mg，平均含藥量為0.354 mg，RSD=1.57%(n=6)。

2.2.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 量取已知含量的同一供試品溶液6份，分別加入等量小檗堿對(duì)照品溶液，依法測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果小檗堿的回收率為97.29%，RSD=2.09%(n=6)。

2.3 體外釋放度測(cè)定 按照《中華人民共和國藥典》2010年版二部，透皮貼劑應(yīng)照附錄釋放度測(cè)定法第三法測(cè)定。將0.9%氯化鈉溶液加入溶出杯內(nèi)，預(yù)溫至(32±0.5)℃；取微粉化雙黃樸貼劑3 cm×3 cm，去除聚乙烯薄膜，固定于兩層碟面之間，釋放面朝上，再將網(wǎng)碟置于燒杯下部，并使貼劑與槳底旋轉(zhuǎn)面平行，兩者相距(25±2) mm，開始攪拌，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，并在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)分別取樣，取樣位置在介質(zhì)液面與槳葉上端之間正中，離杯壁不得少于1 cm，取樣后立即補(bǔ)充等體積釋放介質(zhì)，釋放液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定。按以下公式計(jì)算單位面積累積釋放量[Q，μg·(cm2)-1]和累積釋放百分率(Q%)。

Qn：t時(shí)間藥物的單位面積累積釋放量[μg·(cm2)-1]；Cn：t時(shí)間濃度測(cè)量值；Ci：t時(shí)間以前濃度測(cè)量值；V：溶出介質(zhì)總體積(500 mL)；Vo：每次取樣體積(3 mL)，A：有效擴(kuò)散面積(9 cm2)；W：制劑中小檗堿的含量。以體外累積釋放率對(duì)時(shí)間作圖，見圖2，以單位面積累積釋放量(Q)對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，微粉化雙黃樸水凝膠貼劑單位面積的累積釋放量以Higuchi方程的擬合度較優(yōu)，說明制劑屬于骨架釋藥型釋藥系統(tǒng)，釋藥速率是7.934 μg·(cm2)-1·h1/2。

圖2 小檗堿體外釋放曲線

2.4 體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.4.1 離體鼠皮的制備與處理 取健康大鼠，腹部皮膚涂布脫毛膏，溫水洗凈，禁食不禁水喂養(yǎng)24 h后處死，剪下腹部皮膚，去除皮下脂肪，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗數(shù)次，鋁箔包裹，放置在-20 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)用完。

Qn：t時(shí)間藥物的單位面積累積透過量[μg·(cm2)-1]；Cn：t時(shí)間濃度測(cè)量值；Ci：t時(shí)間以前濃度測(cè)量值；V：接收液總體積(4 mL)；Vo：每次取樣體積(1 mL)；A：有效擴(kuò)散面積(0.85 cm2)；J：透皮速率常數(shù)。以小檗堿的累積滲透量Q對(duì)時(shí)間t作圖，結(jié)果見圖3，以6份樣品12 h內(nèi)平均累積透皮量Q對(duì)t進(jìn)行回歸得Q=0.571X+0.234(r=0.997)，表明貼劑的經(jīng)皮滲透符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)過程，其滲透速率是0.571 μg·(cm2)-1·h-1。、

圖3 小檗堿經(jīng)皮滲透曲線

3 討論

微粉化雙黃樸水凝膠貼劑基質(zhì)組成較多，包括骨架材料、增粘劑、保濕劑、交聯(lián)劑、透皮促進(jìn)劑、填充劑及消泡劑等。聚丙烯酸鈉作為凝膠骨架材料，與高價(jià)金屬離子(如交聯(lián)劑甘羥鋁)交聯(lián)聚合制備的巴布劑成型性好，解決貼劑內(nèi)聚力差、易爛膏等問題?？ú肥橇己玫脑鲳?，生物粘附好，與高價(jià)金屬離子輕度交聯(lián)，增加貼劑的內(nèi)聚力。貼劑的含水量在很大程度上決定基質(zhì)的釋放度、黏著性及賦型性，故保濕劑的選擇十分重要。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究，甘油的保濕效果較好；高嶺土作為一種填充劑，是貼劑成型的關(guān)鍵；交聯(lián)劑甘羥鋁與交聯(lián)調(diào)節(jié)劑酒石酸的質(zhì)量比例為1：2時(shí)，交聯(lián)效果最好；在制備過程中，各種輔料的加入方法、添加順序及攪拌速度等是貼劑成型的關(guān)鍵，如聚丙烯酸鈉和卡波姆需充分溶脹，以增加貼劑的成型性及粘性等。大黃、黃柏及厚樸的混合微粉少量多次加入到純化水中，邊加邊攪拌，制得的溶液更加均勻無團(tuán)塊狀。本法制得的貼劑具有外觀均勻、黏性較好、氣泡較少、無顆粒感等優(yōu)點(diǎn)。

從釋放度結(jié)果可以看出巴布劑中小檗堿在24 h內(nèi)釋放量>90%，巴布劑的體外釋放符合骨架型結(jié)構(gòu)釋放方程的擴(kuò)散模式，即累積釋放量與t1/2成正比。從經(jīng)皮滲透曲線可以看出，小檗堿在皮膚中的滲透可維持24 h以上的穩(wěn)態(tài)釋放速率。因小檗堿的透皮速率0.571 μg·(cm2)-1·h-1小于釋放速率7.934 μg·(cm2)-1·h1/2，說明皮膚是藥物進(jìn)入體內(nèi)的主要限速步驟，該制劑為皮膚控釋型透皮給藥系統(tǒng)。

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Preparation of Micronized Shuanghuangpo Hydrogel Patch and Its Transdermal Penetration In Vitro

HE Jinfeng1,2, HU Xidan3, ZHANG Wenjing2, WAN Sihui3, WANG Zhuo2

(1.AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230031,China；2.DepartmentofPharmacy,ChanghaiHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China；3.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China)

Objective To study preparation of micronizedShuanghuangpohydrogel patch and its characteristics of transdermal penetrationinvitro. Methods MicronizedShuanghuangpohydrogel patch was prepared with some macromolecular water-soluble materials as gel base.The content of berberine was determined by HPLC method.Its transdermal penetrationinvitrowas determined according to the method of Chinese Pharmacopoeia 2010 edition.The rat skin penetration testinvitrowas performed by modified Franz diffusion cell method. Results The hydrogel patch had constant content of berberine.Its release propertyinvitroconformed to Higuchi equation.The penetration of berberine in the hydrogel patch through the rat skin followed zero-order dynamics in 12 h.Its release rate was 7.934 μg·(cm2)-1·h1/2and percutaneous rate was 0.571 μg·(cm2)-1·h-1. Conclusion The micronizedShuanghuangpohydrogel patch is a new transdermal agent with sustained release property.

MicronizedShuanghuangpo；Hydrogel patch；Berberine；Release,Invitro；Transdermal penetration

2014-07-29

2014-11-12

*上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金資助項(xiàng)目(2012Y012B)

何金鳳(1988-)，女，安徽蚌埠人，在讀碩士，研究方向：臨床藥動(dòng)學(xué)研究。電話：(0)15105519483，E-mail ：767126125@qq.com。

王卓(1974-)，男，甘肅人，副主任藥師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床合理用藥及臨床藥動(dòng)學(xué)研究。電話：(0)13818390863，E-mail：wangzhuo088@163.com。

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2015)10-1339-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.021