ERCC1和Ki67表達(dá)與乳腺癌患者含鉑類化療方案敏感性的關(guān)系

魏昕，楊舉倫

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校病理教研室，遵義 563000；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科，昆明 650000)

·藥物與臨床·

ERCC1和Ki67表達(dá)與乳腺癌患者含鉑類化療方案敏感性的關(guān)系

魏昕1，楊舉倫2

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校病理教研室，遵義 563000；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科，昆明 650000)

目的 探討核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)和Ki67的表達(dá)與乳腺癌患者含鉑類化學(xué)治療(化療)方案敏感性的關(guān)系。方法 經(jīng)病理學(xué)確診乳腺癌患者129例，均行紫杉醇和卡鉑聯(lián)合化療方案。吉西他濱1 000 mg·(m2)-1，靜脈滴注30 min，第1，8天；順鉑25 mg·(m2)-1，靜脈滴注，第1～3天；21 d為1個(gè)周期，化療6個(gè)周期。采用免疫組化分析患者腫瘤組織中ERCC1和Ki67的表達(dá)，并比較ERCC1和Ki67不同表達(dá)水平的患者對(duì)鉑類化療方案的敏感性和對(duì)鉑類方案化療患者生存的影響。結(jié)果 129例患者中，ERCC1-Ki67-患者18例，臨床有效率88.89%，3年累積生存率83.33%；ERCC1+Ki67-患者24例，臨床有效率50.00%，3年累積生存率62.50%；ERCC1-Ki67+患者33例，臨床有效率54.55%，3年累積生存率60.60%；ERCC1+Ki67+54例，臨床有效率22.78%，3年累積生存率31.48%。與ERCC1-Ki67-組比較，ERCC1+Ki67-組、ERCC1-Ki67+組和ERCC1+Ki67+組患者對(duì)順鉑為基礎(chǔ)的化療方案的臨床有效率明顯下降(P<0.05)。ERCC1+Ki67+組較ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組也顯著下降(P<0.05)。與ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組比較，ERCC1+Ki67+組患者3年累積生存率明顯下降(P<0.05)，而ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ERCC1+Ki67-組和ERCC1-Ki67+組患者3年累積生存率明顯低于ERCC1-Ki67-組(P<0.05)。結(jié)論 ERCC1和Ki67在乳腺癌組織中表達(dá)水平較高，與患者鉑類化療藥物的臨床有效率密切相關(guān)。

化學(xué)治療藥物；癌，乳腺；切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)；Ki67；化學(xué)治療敏感性

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的腫瘤，也是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一[1]?；瘜W(xué)治療(化療)仍然是治療乳腺癌的主要手段之一，但是在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，部分患者對(duì)化療藥物不敏感，嚴(yán)重影響臨床治療效果[2-3]?；熌退幭嚓P(guān)的基因是目前關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。其中核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(Excision repair cross complementation group 1，ERCC1)是核苷酸修復(fù)過(guò)程中關(guān)鍵的基因，其在維持核苷酸修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但是其過(guò)表達(dá)能使化療藥物損傷的脫氧核糖核苷酸迅速修復(fù)，進(jìn)而達(dá)不到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4-5]。Ki67是一種細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)抗原，其可直接反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀況[6-7]。目前研究顯示，ERCC1和Ki67與鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌以及結(jié)直腸癌的化療耐藥性有關(guān)[8-10]。關(guān)于兩者基因在乳腺癌組織中的表達(dá)情況以及與患者鉑類藥物的化療敏感性、生存率之間的關(guān)系，筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以ERCC1和Ki67蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行正交分組，探討不同表達(dá)水平蛋白對(duì)患者化療耐藥和生存的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院2008年6月—2012年6月收治的初治三陰性乳腺癌患者129例為研究對(duì)象。所有患者均經(jīng)體格檢查、B超、CT、MRI和局部病理學(xué)檢查確診，并且滿足下述條件：①所有患者均為初治，且雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和HER-2均為陰性；②就診時(shí)患者預(yù)期生存時(shí)間均>4個(gè)月；③Karnofsky評(píng)分(KPS)>60分；④患者就診時(shí)未見(jiàn)轉(zhuǎn)移病灶；⑤患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)正常，能夠耐受化療。129例患者年齡30～70歲，平均(58.8±9.8)歲；未婚19例，已婚110例；根據(jù)AJCC乳腺癌cTNM分期：Ⅱ期101例，Ⅲ期28例。病理分型：小葉癌58例，導(dǎo)管癌51例，其他類型20例；組織學(xué)分級(jí)(Elston and Ellis分級(jí)法)：Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)63例，Ⅲ級(jí)47例。

1.2 化療方案 所有患者術(shù)后均行紫杉醇和卡鉑聯(lián)合化療方案。吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030104)1 000 mg·(m2)-1，靜脈滴注30 min，第1，8天；順鉑(揚(yáng)子江藥業(yè)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20053001)25 mg·(m2)-1，靜脈滴注，第1～3天；21 d為一個(gè)周期，化療6個(gè)周期?；颊咴谥委熎陂g給予常規(guī)托烷司瓊止吐。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 腫瘤標(biāo)本來(lái)自于手術(shù)切除腫瘤組織。ERCC1和Ki67鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，羊抗鼠二抗購(gòu)自北京金橋中杉生物有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.4 免疫組化方法 石蠟包埋的標(biāo)本組織連續(xù)切成薄片5 μm，粘附于多聚賴氨酸處理的玻片上，然后在50 ℃烘箱中烤1 h，然后依次用二甲苯及100%，95%，80%和75%乙醇水化，純化水洗滌3次。將玻片置于含檸檬酸鈉的緩沖液中，加熱處理8 min，重復(fù)2次，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌3次；在玻片組織部位滴加3%過(guò)氧化氫(75%甲醇配制)處理30 min去除內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶。PBS洗滌3次，每次5 min。將稀釋的ERCC1和Ki67一抗按照比例稀釋，滴加到玻片組織上，4 ℃ 孵育過(guò)夜，次日PBS洗滌玻片3次，每次5 min；然后在玻片上滴加10%山羊血清稀釋的羊抗鼠的二抗，室溫孵育1 h后，用PBS洗滌3次，每次5 min。然后在玻片上滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液50 μL，邊染色邊在顯微鏡下觀察，染色結(jié)束后用自來(lái)水沖洗，并依次在70%，80%，90%和100%乙醇中脫水，在二甲苯中脫水干燥，并用中性樹(shù)脂固定，在顯微鏡下進(jìn)行固定。

1.5 觀察指標(biāo)和評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 分別對(duì)患者乳腺癌組織中ERCC1和Ki67的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并根據(jù)ERCC1和Ki67的陽(yáng)性或陰性分析其對(duì)吉西他濱聯(lián)合順鉑化療方案的臨床治療有效率，以及對(duì)患者生存率的影響。ERCC1和Ki67評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)采用分級(jí)評(píng)分原則，即每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例，取其平均值作為ERCC1和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例。如陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%視為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞比例>10%視為陽(yáng)性[11]。臨床有效率采用世界衛(wèi)生組織制定的關(guān)于實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定和進(jìn)展。臨床有效率(%)=(完全緩解+部分緩解)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1和Ki67表達(dá)情況分析結(jié)果 見(jiàn)圖1所示，ERCC1和Ki67蛋白均表達(dá)于細(xì)胞核中，呈棕色顆粒形狀。129例患者中，ERCC1陰性患者51例，陽(yáng)性患者78例；Ki67陰性患者42例，陽(yáng)性患者87例。根據(jù)ERCC1和Ki67蛋白表達(dá)情況，將患者分為4組：ERCC1-Ki67-雙陰性患者18例，ERCC1+Ki67-單陽(yáng)性患者24例，ERCC1-Ki67+單陽(yáng)性患者33例，ERCC1+Ki67+雙陽(yáng)性患者54例。4組患者一般資料見(jiàn)表1，患者年齡、TNM分型、病理分型和組織學(xué)分級(jí)等指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 不同ERCC1和Ki67表達(dá)患者臨床治療有效率比較 見(jiàn)表2。與ERCC1-Ki67-比較，ERCC1+Ki67-、ERCC1-Ki67+和ERCC1+Ki67+組患者臨床治療有效率明顯降低(P<0.05)，與ERCC1+Ki67-和ERCC1-Ki67+比較，ERCC1+Ki67+組患者臨床治療有效率下降更顯著(P<0.05)。

2.3 不同ERCC1和Ki67表達(dá)患者生存率比較 129例患者隨訪3～60個(gè)月，沒(méi)有失訪者，平均隨訪(50.9±5.8)個(gè)月。根據(jù)隨訪過(guò)程中患者死亡情況建立生存曲線，見(jiàn)圖2。分析顯示ERCC1-Ki67-、ERCC1+Ki67-、ERCC1-Ki67+和ERCC1+Ki67+組患者累積生存率分別為83.33%，62.50%，60.60%和31.48%。采用Log-Rank檢驗(yàn)對(duì)4組患者累積生存率比較顯示，ERCC1+Ki67-、ERCC1-Ki67+患者累積生存率明顯高于ERCC1+Ki67+組患者(P<0.05)，但是其明顯低于ERCC1-Ki67-患者(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌化療耐藥是目前臨床面臨的主要治療問(wèn)題，因此探討導(dǎo)致化療耐藥的機(jī)制是目前臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)研究顯示，許多基因的異常表達(dá)如P-gp等可能參與乳腺癌的化療耐藥性。其中ERCC1是重要的核苷酸剪切修復(fù)家族成員之一，其主要參與DNA損傷識(shí)別和DNA鏈的切割，在DNA修復(fù)過(guò)程中具有重要作用[12-13]。LORD等[14]在非小細(xì)胞肺癌患者組織中發(fā)現(xiàn)ERCC1 mRNA表達(dá)水平與含鉑類化療藥物存在密切關(guān)系，高表達(dá)患者的生存期明顯短于低表達(dá)患者。另一項(xiàng)前瞻性研究顯示ERCC1高表達(dá)的患者接受卡鉑和吉西他濱聯(lián)合治療的臨床緩解率明顯低于ERCC1低表達(dá)患者，證實(shí)ERCC1表達(dá)水平與鉑類化療藥物的敏感性相關(guān)[15]。Ki67抗原是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，參與細(xì)胞的有絲分裂，目前研究顯示其在腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[16-17]。近年來(lái)，有學(xué)者也提出其與腫瘤化療敏感性相關(guān)。一項(xiàng)直腸癌研究顯示Ki67高表達(dá)的患者對(duì)放化療的敏感性明顯降低，接受化療的Ki67指數(shù)較高的患者生存期明顯低于Ki67低表達(dá)者[18]。但是這兩個(gè)蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與鉑類化療藥物敏感性之間是否存在關(guān)系，目前報(bào)道較少[19]。因此本研究分析不同ERCC1和Ki67表達(dá)水平的患者接受鉑類化療后的臨床治療有效率和生存率的變化。

ERCC1-Ki67-患者臨床治療有效率明顯高于ERCC1+Ki67-和ERCC1-Ki67+組患者，說(shuō)明ERCC1和Ki67的高水平表達(dá)可能降低患者對(duì)鉑類化療藥物的敏感性。如果這一結(jié)果成立，則ERCC1+Ki67+表達(dá)雙陽(yáng)性患者臨床治療有效率則更低。本研究結(jié)果如預(yù)期，發(fā)現(xiàn)ERCC1+Ki67+組患者臨床治療有效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ERCC1-Ki67+和ERCC1+Ki67-組患者。這一結(jié)果充分說(shuō)明ERCC1和Ki67的高表達(dá)與乳腺癌患者鉑類化療的臨床治療有效率呈負(fù)相關(guān)。即ERCC1和Ki67表達(dá)預(yù)告，臨床治療有效率越低，并表現(xiàn)出協(xié)同疊加效應(yīng)。

A.ERCC1陰性；B.ERCC1陽(yáng)性；C.Ki67陰性；D.Ki67陽(yáng)性

表1 4組患者一般資料比較 例Tab.1 Comparison of baseline data among four groups of patients

表2 4種ERCC1和Ki67表達(dá)患者臨床治療有效率比較 例Tab.2 Comparison of clinical effective rate among four groups of patients with different expression of ERCC1 and Ki67

圖2 4種ERCC1和Ki67表達(dá)水平患者5年累積生存率比較

Fig.2 Comparison of 5-year cumulative survival rate among four groups of patients with different expression of ERCC1 and Ki67

在生存率方面，由于ERCC1和Ki67的高表達(dá)直接導(dǎo)致患者對(duì)化療藥物的耐藥，因此生存時(shí)間ERCC1-Ki67-患者>ERCC1+Ki67-和ERCC1-Ki67+患者> ERCC1+Ki67+患者。

綜上所述，ERCC1和Ki67在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，并與鉑類化療藥物的敏感性有密切關(guān)系。檢測(cè)其表達(dá)水平對(duì)于個(gè)性化選擇化療藥物具有重要意義。但是本研究病例有限，需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，增加結(jié)果的說(shuō)服力。

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ERCC1 and Ki67 Expression in Patients with Breast Cancer and Relationship Between Its Expression and Sensitivity of Platinum Chemotherapy

WEI Xin1, YANG Julun2

(1.DepartmentofPathology,ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563000,China；2.DepartmentofPathology,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Kunming650000,China)

Objective To investigate the expressions of excision repair cross complementation group 1 (ERCC1) and Ki67 in patients with breast cancer, and the relationships between their expressions and sensitivity of platinum-based chemotherapy. Methods Totally, 129 cases were pathologically diagnosed as breast cancer.Paclitaxel and carboplatin were used simultaneously.Chemotherapy regimen was as follows: Gemcitabine 1 000 mg·(m2)-1, IV drop on day 1 and 8；cisplatin 25 mg·(m2)-1, IV drop on day 1-3, for six cycles (21 days a cycle).ERCC1 and Ki67 expression in tumor tissue was observed by immunohistochemical analysis.Platinum-based chemotherapy sensitivity and survival of patients with different levels of ERCC1 and Ki67 expression were analyzed. Results In 129 patients, 18 cases were ERCC1 and Ki67 double-negative (ERCC1-Ki67-), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 88.89% and 83.33%, respectively.Twenty-four cases were ERCC1 positive but Ki67 negative (ERCC1+Ki67-), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 50.00% and 62.50%, respectively.Thirty-three cases were ERCC1 negative but Ki67 positive (ERCC1-Ki67+), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 54.55% and 60.60%, respectively.Fifty-four patients were ERCC1 and Ki67 double-positive (ERCC1+Ki67+), and the clinical effective rate and 3-year cumulative survival rate were 22.78% and 31.48%, respectively.Compared with ERCC1-Ki67-group, the clinical treatment efficiencies of cisplatin-based chemotherapy in ERCC1+Ki67-group, ERCC1-Ki67+group, and ERCC1+Ki67+group were significantly decreased (P<0.05).The clinical treatment efficiency in patients of ERCC1+Ki67+group with cisplatin-based chemotherapy was significantly decreased as compared with ERCC1+Ki67-group and ERCC1-Ki67+group (P<0.05).Compared with ERCC1-Ki67-group, three-year cumulative survival rate in patients of ERCC1+Ki67-group and ERCC1-Ki67+group, ERCC1+Ki67+group was significantly decreased (P<0.05).Compared with ERCC1+Ki67-group and ERCC1-Ki67+group, three-year cumulative survival rate in patients of the ERCC1+Ki67+group was significantly decreased (P<0.05). Conclusion The expression levels of ERCC1 and Ki67 in breast cancer were high.Their expression levels are closely related with clinical efficiency of platinum-based chemotherapy.

Chemotherapy drugs；Cancer, breast；Excision repair cross complementation group 1；Ki67；Chemosensitivity

2014-09-29

2014-12-20

魏昕(1975-)，女，貴州遵義人，副教授，學(xué)士，研究方向：病理學(xué)與病理生理學(xué)、乳腺癌。電話：(0)18877339318，E-mail：gfdxj8641@163.com。

R979.1；R737.9

B

1004-0781(2015)10-1314-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.014