貝那普利和曲尼司特抗糖尿病腎病氧化應(yīng)激效應(yīng)比較*

王曉慧，張新，何泳，彭清平，楊國勝，李明梅，劉端，穆昌軍

(武漢市第五醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430050)

貝那普利和曲尼司特抗糖尿病腎病氧化應(yīng)激效應(yīng)比較*

王曉慧，張新，何泳，彭清平，楊國勝，李明梅，劉端，穆昌軍

(武漢市第五醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430050)

目的 觀察血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制藥(ACEI)貝那普利和曲尼司特是否通過抑制硫氧還蛋白(Trx)而產(chǎn)生抗糖尿病腎病(DN)氧化應(yīng)激效應(yīng)。方法 雄性SD大鼠40只，隨機分為正常對照組、模型對照組、曲尼司特組、貝那普利組，每組10只。正常對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；模型對照組、曲尼司特組、貝那普利組給予高糖高脂飲食造糖尿病腎病模型。造模成功后，模型對照組予普通飲食喂養(yǎng)；曲尼司特組予普通飲食喂養(yǎng)及曲尼司特400 mg·kg-1·d-1，灌胃12周；貝那普利組予普通飲食喂養(yǎng)及貝那普利10 mg·kg-1·d-1，灌胃12周。觀察各組大鼠24 h尿蛋白定量、血糖、血尿素氮、血肌酐及腎臟病理的變化，應(yīng)用Western-blot測定Trx的含量。結(jié)果 貝那普利組和曲尼司特組與模型對照組比較血糖、尿蛋白、肌酐、尿素氮、腎小球硬化指數(shù)、腎重/體質(zhì)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，貝那普利組和曲尼司特組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。曲尼司特與貝那普利均有效減輕腎臟病理變化，并能上調(diào)糖尿病腎病大鼠腎組織中Trx的表達。貝那普利組Trx水平升高較曲尼司特組更顯著。 結(jié)論 曲尼司特和貝那普利均具有抗糖尿病腎病氧化應(yīng)激效應(yīng)，而貝那普利較曲尼司特更顯著，其機制除抗纖維化外，還能顯著提高Trx的表達，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩糖尿病腎病的進展。

血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制藥；曲尼司特；貝那普利；糖尿病腎??；硫氧還蛋白；氧化應(yīng)激

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)在許多國家被認為是終末期腎病的主要原因之一，其發(fā)病率及患病率日益增加[1]。DN的病因及發(fā)病機制較多，其中有研究認為氧化應(yīng)激可能成為共同通道之一[2]。研究證實血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制藥(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)類藥物貝那普利和曲尼司特均具有抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，能延緩DN的進展[3]。硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是細胞內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激效應(yīng)[4]。因此，測定Trx水平可反映機體的氧化應(yīng)激水平。筆者在本研究通過檢測DN大鼠經(jīng)貝那普利和曲尼司特治療前后Trx的表達水平，判斷兩藥抗DN氧化應(yīng)激的療效，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠40只，雄性，12周齡，由同濟醫(yī)學(xué)院動物中心提供，合格證號：C5720030111，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2005-0033，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2010-0009，體質(zhì)量180～200 g。動物使用協(xié)議由江漢大學(xué)動物保健和使用委員會進行審核和批準。動物飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度50%～70%，室內(nèi)溫度20～26 ℃，12 h光照、12 h黑暗。

1.2 藥品及試藥 鏈脲佐菌素( streptozotocin，STZ，Sigma公司，批號：S0130)；曲尼司特(中國藥科大學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)，批號：120109，規(guī)格：每粒0.1 g)；貝那普利(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號：x1745，規(guī)格：每粒10 mg)；電致化學(xué)發(fā)光(electrochemilu-minescence，ECL)試劑盒(Pierce公司，批號：32109)。

1.3 模型建立與給藥方法 自由飲食條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，建立動物模型。將所有SD大鼠分別從1到40進行編號，運用隨機數(shù)字表法分為正常對照組10只和造模組30只，正常對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高糖高脂飲食。造模組大鼠用6%水合氯醛0.4 mL·(100 g)-1腹腔注射麻醉后，在左背脊柱側(cè)肋弓下腎臟位置切口開腹部，暴露左腎后剝開左腎包膜，結(jié)扎腎蒂后切除左腎，逐層縫合切口。造模組喂養(yǎng)1個月后，腹腔注射STZ 40 mg·kg-1，1周后，大鼠禁飲食12 h測空腹血糖，并記錄每天尿量，判定2型糖尿病腎病大鼠模型建立成功的標準：尿糖強陽性，空腹血糖≥16.7 mmol·L-1，尿量超過正常對照組50%，尿微量白蛋白>30 mg·d-1；造模組大鼠均符合上述標準，再隨機分為模型對照組 (n=10)，予普通飲食喂養(yǎng)；曲尼司特組 (n=10)，予普通飲食喂養(yǎng)及曲尼司特400 mg·kg-1·d-1，灌胃12周；貝那普利組(n=10)，予普通飲食喂養(yǎng)及貝那普利10 mg·kg-1·d-1，灌胃12周。實驗過程中所有動物均存活。收集24 h尿液后，所有大鼠均予以安樂死[5-7]。

1.4 尿糖及生化指標檢測 尿糖檢測采用葡萄糖氧化酶法(干化學(xué)法)。大鼠處死后，進行腎/體質(zhì)量計算和血清生化指標的樣本收集。24 h蛋白尿、血糖、血尿素氮、血清肌酐和腎/體質(zhì)量由日立7600-020-e-自動生化分析儀進行檢測。

1.5 病理檢測 在模型成功并治療12周后處死各組大鼠，取出右腎，去包膜后縱向切開，部分組織置于10%固定液中，做糖原染色(periodic acid-schiff stain，PAS)用作組織學(xué)分析。腎臟病理變化分析：取PAS染色切片在光鏡下觀察各組腎臟病變的程度。根據(jù)RAIJ等[8]方法評價腎小球硬化程度，每切片腎小球平均硬化分數(shù)代表硬化程度。每張標本切片光鏡隨機選取10個視野，計算各張切片的評分，并計算平均值，即為該標本的腎小球硬化指數(shù)。

1.6 Western-blot檢查Trx含量 從大鼠腎組織中提取總蛋白：取腎組織樣品40 μL+loading buffer(×3) 20 μL，混勻；加入15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)，10 μL/core，冰浴跑膠；冰浴轉(zhuǎn)膜[聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜]，90 mA(恒流)，2 h；TBST溶液洗膜3次；10 mL TBST+5%脫脂奶粉，4 ℃，過夜封閉；加入一抗(兔抗鼠Trx1：100)，室溫孵育2 h；再用TBST溶液洗膜3次；加生物素標記的二抗，室溫孵育1 h；TBST溶液洗膜5次；熒光底物A液500 μL+B液500 μL，混勻，與膜孵育顯影2 min，于暗室底片曝光(ECL試劑盒曝光并顯影，掃描顯影條帶)；采用Phoretix2D軟件測定Trx的平均灰度，以同一樣品的Trx與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)條帶的灰度值比值作為Trx蛋白的相對含量[9]。

2 結(jié)果

2.1 生化指標 模型對照組大鼠血糖、尿蛋白、肌酐、尿素氮、腎小球硬化指數(shù)、腎質(zhì)量/體質(zhì)量各指標與正常對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，貝那普利組和曲尼司特組與模型對照組比較各指標明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，貝那普利組和曲尼司特組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 腎組織病理改變 PAS染色顯示，模型對照組部分腎臟體積增加，細胞肥大，輕度系膜細胞增殖，基底膜增厚，管狀上皮細胞變性，腎間質(zhì)可見單核細胞和淋巴細胞浸潤(圖1)。貝那普利組、曲尼司特組上述改變均較模型對照組輕，腎小球體積較模型對照組小，系膜增生無模型對照組明顯；腎小管上皮病變較輕，間質(zhì)內(nèi)單核細胞和淋巴細胞浸潤較模型對照組輕。并且觀察到貝那普利和曲尼司特組腎小球硬化指數(shù)(表1)存在相同的趨勢，兩組均可以顯著減弱腎小球硬化程度。

表1 4組血糖及生化指標檢測值

與正常對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05Compared with normal control group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

A.正常對照組；B.模型對照組；C.曲尼司特組；D.貝那普利組

2.3 Trx 的表達 結(jié)果見圖2。Western-blot檢測顯示，Trx在各組腎組織均有表達，其中正常對照組表達較高，模型對照組表達降低，貝那普利和曲尼司特組表達增高，但較正常對照組偏低，且貝那普利組較曲尼司特組表達水平更高。

3 討論

RAZA等[10]在實驗中觀察到，STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型中，超氧化物明顯增加，這與慢性氧化應(yīng)激明顯有關(guān)。本研究中，在STZ誘導(dǎo)成功的大鼠DN模型中，觀察到大鼠空腹血糖升高、蛋白尿增加、腎臟體積增大、腎重/體質(zhì)量比增加、腎小球硬化指數(shù)升高等DN的特征，并觀察到抗氧化酶水平顯著降低，提示氧化應(yīng)激增強及抗氧化能力降低，這些是DN的發(fā)病機制。

氧化和抗氧化的平衡是維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素之一。Trx為細胞內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)分子之一[11]，在調(diào)節(jié)機體的氧化還原反應(yīng)、抑制細胞凋亡方面起著重要作用[12]，同時它也是一種氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS )水平的升高在糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[14-15]。細胞內(nèi)ROS水平和氧化應(yīng)激的存在不僅取決于活性氧的產(chǎn)生率，而且通過內(nèi)源性抗氧化劑中和與降解，而其機制是通過抗氧化劑Trx結(jié)合并抑制的[16]。研究證實，在DN模型中，Trx能通過減少ROS的產(chǎn)生抑制氧化應(yīng)激，延緩DN的進展[17]。在ANDREW等[18]研究中表明，Trx主要集中表達在腎皮質(zhì)，能夠清除活性氧自由基，避免組織遭受氧化損傷，從而防止糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生。因此，提高腎組織中Trx水平有利于DN的預(yù)防和治療。另外，測定血液或組織中Trx的水平亦能夠間接反映機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.曲尼司特組；D.貝那普利組；與正常對照組比較，t=2.235，*1P<0.05；與模型對照組比較，t=2.768，*2P<0.05，t=2.824，*3P<0.01

圖2 Western-blot檢測4組Trx的表達結(jié)果

A.normal control group；B.model control group；C.Tranilast group；D.benazepril group；Compared with normal control group，t=2.235，*1P<0.05；compared with model control group，t=2.768，*2P<0.05，t=2.824，*3P<0.01

Fig.2 Western blot test on Trx expression in four groups

循證醫(yī)學(xué)證實，腎素-血管緊張肽系統(tǒng)( renin-angiotensin system，RAS)通過氧化應(yīng)激作用過度激活導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能損傷[19]。貝那普利在DN中通過抑制血管緊張肽Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)及抗氧化應(yīng)激糾正內(nèi)皮功能紊亂，達到防止疾病進展的作用。本研究證實貝那普利在DN中確實具有抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，能延緩DN的進展，這與以往學(xué)者的研究是一致的。

曲尼司特是臨床上應(yīng)用已久的藥物，由于其具有抗炎及抗纖維化的作用，已經(jīng)被應(yīng)用于腎臟疾病的治療，證實其具有抗氧化應(yīng)激效應(yīng)[20]，其腎臟保護作用日益受到關(guān)注，確切機制尚未明確。有學(xué)者證實在實驗性DN模型中，曲尼司特能增加Trx的表達，減弱氧化應(yīng)激效應(yīng)，從而延緩DN的進展[3]。本研究證實曲尼司特能降低血清尿素氮、血肌酐和尿蛋白，提示有一定的腎臟保護作用。且曲尼司特組Trx水平升高，病理改變減輕，證實其在DN中可能是通過增加Trx的表達從而起到抗氧化應(yīng)激作用，這與文獻[3]結(jié)果相符。

本實驗中比較貝那普利和曲尼司特對12周末DN大鼠的尿蛋白定量及腎臟病理的改變的影響，及腎組織中Trx的表達情況，及其與腎纖維化的關(guān)系，結(jié)果顯示 Trx在改善DN腎組織纖維化中起著重要的作用，且貝那普利、曲尼司特均能降低DN大鼠的尿蛋白，改善腎功能，減輕腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化，兩用藥組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但貝那普利組Trx表達水平較曲尼司特組高，提示貝那普利減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)更有效。

總之，在這次實驗中更進一步證實貝那普利和曲尼司特兩種藥物的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，氧化應(yīng)激在減少Trx的表達和DN發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，其機制可能是高血糖引起Trx表達減少，進而使調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的非酶系統(tǒng)抑制。Trx可能成為今后抗DN氧化應(yīng)激的新靶點。另外，曲尼司特雖早已應(yīng)用于臨床，但目前對于曲尼司特保護腎臟的作用大部分研究多局限于動物實驗或體外研究，由于種族差異，其對人體是否也具有同樣的保護DN的作用還有待于進一步的臨床研究。

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Comparison of Effect on Antioxidative Stress Between Benezepril and Tranilast in Diabetic Nephropathy Rat

WANG Xiaohui，ZHANG Xin，HE Yong，PENG Qingping，YANG Guosheng，LI Mingmei，LIU Duan，MU Changjun

(DepartmentofNephrology，theFifthHospitalofWuhanCity，Wuhan430050，China)

Objective To investigate ACEI(benazepril)and tranilast exert renoprotective properties in diabetic nephropathy(DN)through the inhibition of thioredoxin(Trx). Methods Forty male SD rats were randomly divided into control group，model control group，tranilast group and benazepril group (n=10 each).Normal control group was fed with normal diet.Other groups were fed with high-glucose high-fat diet to make model control models.Rats in DN，tranilast，and benazepril groups were fed with normal diet，400 mg·kg-1·d-1tranilast plus normal diet，and 10 mg·kg-1·d-1benazepril plus normal diet，respectively，via oral gavage for 12 weeks.The 24-hour proteinuria，blood glucose(BG)，blood urea nitrogen (BUN)，serum creatinine (Scr) and renal pathology changes were detected.Expression of Trx was measured by Western-blot. Results The 24 h urine protein，BG，BUN，Scr，kidney/body weight，and glomerular sclerosis index were significantly decreased in tranilast group and benazepril group，as compaired with model control group (P<0.05)，but there was no statistical difference between the two drug groups (P>0.05).Both tranilast and benazepril can reduce renal pathological changes，and can increase the expression of Trx of DN rats，but benazepril had a more significant effect on increasing Trx expression. Conclusion Both tranilast and benazepril have renoprotective function in DN，and benazepril is more effective in delaying the progression of diabetic nephropathy by increasing Trx expression and decreasomg oxidative stress.

Angiotensin converting enzyme inhibitors； Tranilast； Benazepril； Diabetic nephropathy；Thioredoxin； Antioxidative stress

2015-02-15

2015-04-16

*武漢市衛(wèi)生局科研基金項目(WX10C24)

王曉慧(1972-)，女，湖北武漢人，副主任醫(yī)師，博士，主要從事慢性腎臟病研究。電話：(0)13971084589，E-mail：390638252@qq.com。

穆昌軍(1969-)，男，湖北武漢人，副主任醫(yī)師，學(xué)士，主要從事腎臟病研究。電話：(0)13871460157，E-mail：718010821@qq.com。

R972.4；R587.1

A

1004-0781(2015)10-1276-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.003