磁性固相萃取-液相色譜法測定環(huán)境水樣中痕量的微囊藻毒素

連麗麗郭亭秀吳玉清金麗婁大偉孫大志（吉林化工學院分析化學系,吉林30）（吉林大學無機與超分子國家重點實驗室,長春300）

磁性固相萃取-液相色譜法測定環(huán)境水樣中痕量的微囊藻毒素

連麗麗1郭亭秀1吳玉清2金麗1婁大偉*1孫大志*11（吉林化工學院分析化學系,吉林132022）2（吉林大學無機與超分子國家重點實驗室,長春130012）

通過水熱合成法制備出磁性膨潤土復合材料作為固相萃取吸附劑,采用磁性固相萃?。∕SPE）前處理技術(shù),結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC/UV）,建立了對環(huán)境水中痕量生物污染物微囊藻毒素（MC-LR）的快速檢測分析方法。通過對MSPE技術(shù)中吸附劑用量、吸附時間、洗脫溶劑的配比、體積等參數(shù)的優(yōu)化,實現(xiàn)水樣中MC-LR的最優(yōu)提取。在最優(yōu)條件下,檢出限和定量限分別為0.75和1.5 ng/L,遠低于國際衛(wèi)生組織所制定的飲用水中微囊藻毒素所允許的最高濃度。目標物在0.25～250μg/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性（R2=0.9993）。本方法所用的磁性固相萃取吸附劑具有制備簡單、價格低、易于固液分離等優(yōu)點,配合HPLC/UV可實現(xiàn)環(huán)境水樣中痕量MC-LR的快速、靈敏監(jiān)測。

磁性；固相萃??；微囊藻毒素；高效液相色譜

1 引 言

固相萃取技術(shù)（SPE）具有富集能力強,操作簡單等優(yōu)點,近年來被廣泛應用于環(huán)境分析、食品分析、生物分析等樣品前處理領(lǐng)域[1,2]。但是,SPE存在柱成本較高,對特定分析物選擇性差,且需要大量有機溶劑進行萃取柱的預處理及目標物質(zhì)的洗脫等制約因素[3]?；?SPE的不足,磁性固相萃?。∕SPE）作為一種新型樣品前處理技術(shù)迅速發(fā)展起來,并引起了研究者的廣泛關(guān)注。MSPE使用磁性納米材料作為目標分析物的載體,具有易于功能化修飾、比表面積大、分散性強、便于固液分離等優(yōu)勢。MSPE操作簡單、對分析物富集效率高,并可以實現(xiàn)某些分析物在復雜基質(zhì)中的選擇性分離。該方法也避免了SPE在處理生物、環(huán)境樣品時常出現(xiàn)的柱堵塞問題。目前,MSPE已被成功應用于環(huán)境水中多種有機污染物、無機金屬離子污染物的高效富集,配合HPLC、GC等檢測手段,實現(xiàn)了復雜樣品中痕量污染物的準確定性與定量分析[4～7]。

微囊藻毒素（MCs）是由藍藻水化所產(chǎn)生的一類生物污染物,目前已發(fā)現(xiàn)80余種結(jié)構(gòu)極為相似的異構(gòu)體,其中微囊藻毒素MC-LR為分布最廣、毒性最強的一種構(gòu)型[8,9]。MCs的靶向器官為肝臟,長期飲用含有高濃度MCs的飲用水甚至可能誘發(fā)肝癌,而且MCs可以通過食物鏈作用進行生物富集,具有持久性生物污染[10]。MCs性質(zhì)穩(wěn)定,耐高溫及極端pH,常規(guī)自來水工藝也不能將其有效去除。鑒于MCs污染的普遍性及其較強的毒性,世界衛(wèi)生組織[11]及我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》[12]均規(guī)定生活飲用水、地表水源地MCs的濃度不得高于1.0μg/L（以MC-LR為代表）。由于環(huán)境水樣基質(zhì)復雜,而且極低濃度的MCs已經(jīng)構(gòu)成了生物毒素污染,因此需配合必要的樣品前處理技術(shù)并結(jié)合HPLC等分析方法對MCs進行準確監(jiān)測。近年來,基于磁性納米吸附劑的MSPE技術(shù)在痕量有機、無機污染物萃取分離領(lǐng)域已取得了一定的進展。但是,將MSPE-HPLC應用于水樣中生物污染物的檢測研究較少。目前,以磁性膨潤土作為吸附劑的磁性固相萃取-高效液相色譜法檢測環(huán)境水樣中MCs的研究還未見報道。我們的前期工作制備了CoFe2O4磁性納米材料,用于去除水中微囊藻毒素[13]。在此基礎上,本研究制備出十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）修飾的磁性膨潤土復合材料,并以此作為固相萃取吸附劑,通過對萃取條件和洗脫條件的優(yōu)化,結(jié)合HPLC/UV分析,建立一種操作簡便、穩(wěn)定性好、綠色環(huán)保的環(huán)境水樣中痕量生物污染物MC-LR的定量分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津科技有限公司）,配置SPD-20A紫外檢測器；KQ-500D型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

微囊藻毒素MC-LR（色譜純,臺灣藻研公司）；甲醇、乙腈（色譜純,天津大茂化學品有限公司）；膨潤土（化學純,天津光復化學試劑有限公司）；三氟乙酸（TFA,色譜純,上海阿拉丁公司）；Mill-Q超純水（美國Millipore公司）；其它試劑均為分析純。

2.2 標準溶液的配制

移取500μLMC-LR（50μg/mL）標準品,置于10 mL潔凈的棕色螺紋口透明玻璃瓶,配制成濃度為5.0μg/mL的MC-LR儲備溶液5 mL,4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm,5μm,Agilent科技有限公司）；檢測波長：238 nm；流動相：乙腈-H3PO4（35∶65,V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.4 固相萃取吸附劑的制備

2.4.1 磁性膨潤土（Fe3O4@B）的制備稱取膨潤土0.5 g,三氯化鐵（FeCl3·6H2O）1.35g,無水醋酸鈉3.60g,聚乙二醇1.00 g,溶于40 mL乙二醇中,將混合物攪拌20min后轉(zhuǎn)入50 mL不銹鋼反應釜中密封,置于190℃烘箱中反應8 h。冷卻后的液體轉(zhuǎn)移至100 mL燒杯中,磁性分離出磁性膨潤土Fe3O4@B,用水和無水乙醇充分洗滌,并溶于100 mL水,分散均勻。

2.4.2 磁性有機膨潤土（Fe3O4@B@CTAB）的制備將上述混合溶液超聲10min后,轉(zhuǎn)移到250 mL三口燒瓶中,加入0.5 g CTAB,室溫反應24 h。制得的Fe3O4@B@CTAB通過外加磁場分離,以水多次洗滌,60℃真空干燥,裝瓶備用。

2.5 磁性固相萃取MC-LR

20 mL水中加入30μL 5.0μg/mLMC-LR標準品,得到7.5μg/L MC-LR溶液。將適量Fe3O4@B @CTAB加入到上述溶液中,旋渦振蕩20min后,使用磁鐵將吸附了MC-LR的Fe3O4@B@CTAB集中于樣品瓶底部,棄去上清液。隨后加入400μL乙腈-0.1％TFA水溶液（3∶1,V/V）洗脫液,超聲20min,吸取含有MC-LR的洗脫液,用氮氣濃縮并定容至200μL,以HPLC進行定量分析。

2.6 采樣和水樣處理

環(huán)境水樣取樣于藍藻生長旺盛的中國太湖（2015年7月）,取樣后4℃下保存于棕色玻璃瓶中。水樣首先在10000 r/min下離心10min棄去沉淀物,并將上清液通過0.45μm的濾膜。然后將MSPE吸附劑分散于20 mL上述溶液中,萃取其中的MC-LR,經(jīng)過洗脫,定容到200μL后,HPLC定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 Fe3O4@B@CTAB的制備與表征

近期研究發(fā)現(xiàn),磁性鋁柱撐膨潤土可有效去除環(huán)境水中的生物污染物MC-LR[14]。而CTAB修飾的膨潤土@Fe3O4復合材料,不但具有較強的磁性,而且可以實現(xiàn)大體積樣品中痕量MC-LR的高效萃取及有效洗脫,配合HPLC精準檢測低濃度環(huán)境水中的生物污染物MC-LR。

圖1A為Fe3O4@B@CTAB的FT-IR譜圖。其中580 cm-1為Fe3O4的FeO彎曲振動吸收峰；1035 cm-1處的強烈吸收帶歸屬于膨潤土中SOSi骨架振動；而在2925,2850和1475 cm-1處為季銨鹽中CH伸縮振動以及氨基的特征吸收。結(jié)果表明,已成功制備出功能化磁性膨潤土復合材料Fe3O4@B@CTAB。Fe3O4@B@CTAB的TGA結(jié)果如圖1B所示,當溫度由室溫上升至100℃,吸附劑失去表面水分；當溫度由200℃升至600℃,Fe3O4@B@CTAB失去CTAB及膨潤土的層間水。此曲線說明Fe3O4@B@CTAB具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖1 磁性膨潤土的性能表征：（A）FT-IR譜圖；（B）TGA曲線Fig.1 Characterization ofmagnetic sorbent：（A）FT-IR spectrum；（B）Thermogravimetric curve

3.2 萃取條件優(yōu)化

3.2.1 磁性吸附劑的用量分別將1,2,3,4和6 mg的磁性吸附劑用于萃取分離20 mL加標溶液中的MC-LR,考察磁性吸附劑用量對萃取效率的影響,結(jié)果見圖2A。當吸附劑的質(zhì)量增大至2 mg,萃取效率顯著增大,而當吸附劑加入量由2 mg繼續(xù)增大至6 mg時,萃取效率逐漸減小。這是因為Fe3O4@B@CTAB對MC-LR具有較強的富集能力,少量吸附劑即可實現(xiàn)大體積樣品中MC-LR的有效萃取,而較大量的吸附劑反而給MC-LR的有效洗脫帶來困難。因此選擇固相萃取吸附劑的加入量為2 mg。

圖2 （A）吸附劑的加入量對萃取效率的影響；（B）溶液pH值對萃取效率的影響；（C）萃取溫度對萃取效率的影響；（D）萃取時間對萃取效率的影響Fig.2 Effect of（A）weight of sorbents,（B）solution pH,（C）solution temperature and（D）extraction time on the extraction performance

3.2.2 萃取劑的pH值溶液的pH值直接影響吸附劑與吸附質(zhì)的表面電荷分布。由于修飾了有機長鏈分子CTAB,Fe3O4@B@CTAB表面帶有大量的正電荷,而且隨著pH值降低,其表面所帶正電荷數(shù)目增多；在pH 2.1～12之間時,生物分子MC-LR表面帶有負電荷[13]。因此,當pH=2.1時,帶有大量正電荷的Fe3O4@B@CTAB對MC-LR分子具有更強的萃取能力；隨著溶液pH值繼續(xù)升高,Fe3O4@B@CTAB表面正電荷的數(shù)目逐漸減少,靜電力的減弱導致其對MC-LR萃取效率逐漸降低（圖2B）。

3.2.3 萃取溫度考察了萃取溫度（20℃,30℃,40℃,50℃）對實驗結(jié)果的影響。如圖2C所示,當溫度由20℃升高至40℃,Fe3O4@B@CTAB對MC-LR的萃取效率逐漸提高；當萃取溫度繼續(xù)升高至50℃,萃取效率逐漸降低。固相萃取過程是目標分子在固相萃取吸附劑表面不斷發(fā)生吸附和解吸附的動態(tài)平衡過程,當溫度由20℃升高至40℃,分子運動速率加快,分析物MC-LR分子能夠快速擴散至吸附劑表面并達到動態(tài)的吸附平衡；而繼續(xù)升高溫度,可能加速了MC-LR在吸附劑表面解吸附速率,導致萃取效率下降。

3.2.4 萃取時間在保證較高萃取效率的前提下應盡量縮短萃取時間提高分析效率。如圖2D所示,萃取時間介于1～10min時,隨著萃取時間的延長,萃取效率逐漸增大；隨后萃取時間增大反而導致了萃取效率的降低。基于以上實驗結(jié)果,選擇10min為最佳萃取時間。

3.3 洗脫條件的優(yōu)化

3.3.1 洗脫液的選擇洗脫液的選擇也是影響萃取效率的關(guān)鍵因素。考察了不同比例（0％,25％, 50％,75％,100％）乙腈-水對MC-LR萃取效率的影響,結(jié)果表明,純水和純乙腈溶液都不能將MC-LR從吸附劑表面洗脫；洗脫劑的組成為75％乙腈-水溶液,得到的萃取效率最高。溶液的酸度也可能影響MC-LR的洗脫過程,在洗脫液中加入不同比例的三氟乙酸,萃取結(jié)果如圖3A所示,當三氟乙酸濃度從0％增加到0.6％,萃取效率隨之增加；當三氟乙酸的濃度繼續(xù)增大,萃取效率增加較小,由于三氟乙酸易揮發(fā),因此選擇75％乙腈-1.0％TFA作為洗脫液。洗脫液的體積（100,200,400,600μL）也是影響萃取效率的重要因素。結(jié)果表明,400μL的洗脫液足以獲得滿意的萃取效率,繼續(xù)增大洗脫液體積基本不會改變萃取結(jié)果。

3.3.2 洗脫時間和洗脫溫度的選擇為快速、高效地將MC-LR從MSPE吸附劑表面洗脫,在超聲輔助下,考察洗脫時間對萃取效率的影響。如圖3B所示,15min后繼續(xù)延長洗脫時間,將降低萃取效率,因此洗脫時間選擇15min。

當洗脫溫度介于20℃～60℃之間,隨著溫度升高,萃取效率逐漸降低,這說明較低的溫度可以使MCLR從固相萃取吸附劑表面有效洗脫；繼續(xù)降低溫度至10℃,萃取效率反而下降,這可能是溶液的溫度過低降低了MC-LR分子的解吸附速率,使萃取效率降低。因此選擇20℃對MC-LR進行洗脫（圖3C）。

圖3 TFA含量（A）；超聲時間（B）和超聲溫度（C）對萃取效率的影響Fig.3 Effect of（A）amounts of trifluoroacetic acid（TFA）,（B）desorption time and（C）desorption temperature on extraction performance

3.4 方法評價

配制濃度為0.25,2.5,25,50,125和250μg/L的MC-LR標準溶液,在最優(yōu)條件下進行樣品前處理,在確定的色譜條件下,以待測組分的響應值對相應的質(zhì)量濃度繪制標準曲線。本方法在0.25～250μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系,標準曲線方程為y=1158.7x-1101.5,相關(guān)系數(shù)為0.9993。檢出限0.75 ng/L。

3.5 回收率和精密度

在不含MC-LR組分的環(huán)境水樣品中添加MC-LR標準溶液,配制0.25,25和250μg/L（低、中、高）3個濃度水平的MC-LR溶液,按照上述方法進行MSPE處理、并將每個水平平行測定6次,計算回收率和精密度。3個添加水平的平均回收率分別為89.0％,93.3％和93.3％,相對標準偏差（RSD）為12.7％,3.5％和5.6％。

3.6 實際樣品檢測

實際樣品于2015年7月8日取自藍藻生長旺盛的太湖。將20 mL水樣經(jīng)0.45μm水系膜過濾后,用建立的基于Fe3O4@B@CTAB材料的MSPE方法對太湖中的MC-LR進行萃取,并通過HPLC/UV檢測,獲得實際水樣中MC-LR的濃度為1.4μg/L。此結(jié)果表明太湖中微囊藻毒素應予以重視。

3.7 與其它方法比較

將建立的MSPE-HPLC法與目前常用的SPE-HPLC相比（表1）,結(jié)果表明,本方法具有較低的檢出限；較寬的線性范圍,且Fe3O4@B@CTAB制備成本低,無需大量有機溶劑活化即可實現(xiàn)MC-LR的高效洗脫。因此,本方法更加綠色環(huán)保。結(jié)果表明,本實驗成功建立了測定環(huán)境水樣中生物污染物MCLR的MSPE-HPLC/UV分析方法。此方法僅需2.0 mg磁性吸附劑、渦旋萃取10min、400μL洗脫溶劑、15min的洗脫時間即可實現(xiàn)20 mL水樣中痕量MC-LR的高效富集、檢測。該方法具有價格低、有機溶劑消耗少、檢出限低等優(yōu)勢。

表1 MSPE與SPE前處理方法對MC-LR檢測結(jié)果對比Table 1 Comparision of the developed analyticalmethod and the literature methods

1 GiakisikliG,Anthemidis A N.Anal.Chim.Acta,2013,789：1-16

2 BAISha-Sha,LIZhi,ZANG Xiao-Huan,WANGChun,WANG Zhi.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41（8）：1177-1182

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4 Mohamed EM,Somia B A,Maher M O,Tarek M A F.Fuel.,2015,139：614-621

5 WANG Chao,PENG Tao,LüYi-Bing,TENG En-Jiang.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41（12）：1844-1850

王超,彭濤,呂怡兵,滕恩江.分析化學,2013,41（12）：1844-1850

6 Zhao B S,He M,Chen B B,Hu B.Spectrochim.Acta B,2015,107：115-124

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楊靜東,胡梁斌,周威,陳健,石志琦.生態(tài)環(huán)境學報,2009,18（6）：2044-2050

11 World Health Organization.Guidelines for Drinking-Water Quality,3rd Edition.Geneva：World Health Organization,2004

12 GB/T 5749-2006,Standards for Drinking Water Quality.National Standards of the People′s Republic of China

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連麗麗,曹雪玲,吳玉清,婁大偉.分析測試學報,2015,34（10）：1095-1100

14 Lian L L,Cao X L,Wu Y Q,Sun D Z,Lou DW.Appl.Surf.Sci.,2014,15：245-251

15 Lee J,Walker H W.Colloid.Surface.A,2011,373：94-100

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郭堅,楊新磊,葉明立.分析化學,2011,39（8）：1256-1260

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馮桂學,劉莉,王明泉,孫韶華,賈瑞寶.化學分析計量,2014,23（6）：34-36

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19 ZHANGWei-Hao,XU Xiao-Qing.Chinese J.Anal.Chem.,2001,29（5）：522-525

張維昊,徐小清.分析化學,2001,29（5）：522-525

20 Shan Y H,Shi X Z,Dou A,Zou C J,He H B,Yang Q,Zhao SM,Lu X,Xu GW.J.Chromatogr.A,2011,1218：1743-1748

（Received 15 July 2015；Accepted 18 September 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21375046,21405058）,Science and Technology Development Plant of Jilin Province（No.20130521024JH）,The research Foundation of education bureau of Jilin Province（No.2015438）

Determ ination of M icrocystin-LR in EnvironmentalW ater by M agnetic Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

LIAN Li-Li1,GUO Ting-Xiu1,WU Yu-Qing2,JIN Li1,LOU Da-Wei*1,SUN Da-Zhi11（Department ofAnalytical Chemistry,Jilin Institute ofChemical Technology,Jilin 132022,China）
2（State Key Laboratory for Supramolecular Structure and Materials,Jilin University,Changchun 130012,China）

A rapid analyticalmethod was established for the determination of trace amounts ofmicrocystins （MC-LR）in environmentalwater samples by magnetic solid phase extraction（MSPE）coupled with HPLC/UV based on a magnetic bentonite sorbent fabricated by solvothermal synthesis method.Several factors influencing the extraction efficiency of MC-LR,such as sorbent amount,pH condition,sample volume, adsorption and desorption time,and desorption solvent were investigated and optimized.Under the optimal extraction conditions,the limits of detection and quantification for themethod were 0.75 ng/L and 1.5 ng/L respectively,which was far below the guideline recommended by theWorld Health Organisation.Themethod showed a good linearity（R2=0.9993）in the ranges of0.25-250μg/L for MC-LR.The MSPE sorbentwas simple in preparation,low cost andmagnetizable,and the developed MSPE-HPLVmethod was suitable for the rapid and sensitive determination of MC-LR in nature water samples.

Magnetic；Solid phase extraction；Microcystins；High performance liquid chromatography

10.11895/j.issn.0253-3820.150567

2015-07-15收稿；2015-09-18接受

本文系國家自然科學基金（Nos.21375046,21405058）,吉林省科技發(fā)展計劃項目（No.20130521024JH）,吉林省教育廳"十二五"科學技術(shù)研究項目（No.2015438）資助

E-mail：4159495@163.com