超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測柑橘中的5種鏈格孢霉毒素

蔣黎艷趙其陽龔 蕾劉雁雨張耀海馬 良焦必寧,,1（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶00715）（農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶）,西南大學(xué)柑桔研究所,重慶0071）（國家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶0071）（農(nóng)業(yè)部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心,重慶0071）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測柑橘中的5種鏈格孢霉毒素

蔣黎艷1,2趙其陽2,4龔 蕾2,4劉雁雨2,4張耀海2,4馬 良*1,2焦必寧*1,2,3,41（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶400715）
2（農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶）,西南大學(xué)柑桔研究所,重慶400712）
3（國家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶400712）4（農(nóng)業(yè)部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心,重慶400712）

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測柑橘中騰毒素、鏈格孢酚、交鏈格孢酚單甲醚、交鏈孢烯和細(xì)交鏈格孢菌酮酸5種鏈格孢霉毒素的新方法。樣品經(jīng)改進(jìn)的QuEChERS（快速、簡單、廉價(jià)、高效、靈活和安全）方法一步完成萃取凈化,采用乙腈-甲酸（1.5％）提取,無水MgSO4和NaCl鹽析,以ACQUITY UPLC BEH C18柱為分離柱,用乙腈和0.1％甲酸溶液進(jìn)行梯度洗脫,電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)模式監(jiān)測,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定。在本方法條件下,5種鏈格孢霉毒素在2.0～100μg/L濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＞0.9922）,檢出限在0.11～0.91μg/kg之間。在5,20和100μg/kg加標(biāo)水平下,5種毒素的回收率在71％～112％之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1％～9.9％,能滿足柑橘中鏈格孢霉毒素檢測的要求。

鏈格孢霉毒素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；柑橘；QuEChERS法

1 引 言

鏈格孢菌是導(dǎo)致水果、蔬菜及冷藏食品腐敗變質(zhì)的主要微生物,可以產(chǎn)生多種次生代謝物[1,2]。目前,從鏈格孢菌中已經(jīng)分離了超過30種明顯有毒性的毒素,統(tǒng)稱為鏈格孢霉毒素。有研究表明,這些毒素具有致突變能力、致癌、致畸、細(xì)胞毒性和基因毒性等毒性,最為重要的有鏈格孢酚（Alternariol, AOH）、交鏈格孢酚單甲醚（Alternariolmonomethyl ether,AME）、交鏈孢烯（Altenuene,ALT）、騰毒素（Tentoxin,Ten）及細(xì)交鏈格孢菌酮酸（Tenuazonic acid,TeA）,而TeA是其中唯一的含氮代謝產(chǎn)物,被認(rèn)為是毒性最大且最重要的鏈格孢霉毒素[3～6]。

柑橘是全球最大的水果作物之一,具有較高的經(jīng)濟(jì)和保健價(jià)值[7]。有研究報(bào)道鏈格孢菌屬能引發(fā)寬皮柑橘的褐斑病、粗皮檸檬的葉斑病和多種柑橘的黑斑病等病害,同時(shí)在果實(shí)發(fā)病中伴有鏈格孢霉毒素產(chǎn)生,給柑橘產(chǎn)業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失,危害食用者的健康[8,9]。目前鏈格孢霉毒素的研究主要集中在番茄、蘋果和芒果等[10,11],柑橘中5種鏈格孢霉毒素研究基本上是空白；而且我國現(xiàn)有的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)還未規(guī)定鏈格孢霉毒素的限量[12],也沒有制定柑橘類水果中鏈格孢霉毒素的檢測方法,因此,盡快建立簡單、快速、高效、靈敏的柑橘類水果中鏈格孢霉毒素的檢測方法很有必要。

已報(bào)道的鏈格孢霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[13]、高效液相色譜法（HPLC）[14]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[15]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[17]和超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）[18]等,這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn),近年來對多種鏈格孢霉毒素的定量分析主要集中在后兩種方法的研究和應(yīng)用方面。

樣品的前處理技術(shù)在方法檢測中起到至關(guān)重要的作用,QuEChERS（Quick,easy,cheap,effective, rugged and safe）技術(shù)是一項(xiàng)新的高效提取凈化技術(shù),具有提取凈化效率高、環(huán)境污染小、操作簡單快速等優(yōu)點(diǎn)[19],因其簡單性和適用性,近年來廣泛應(yīng)用于同時(shí)分析農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)獸藥、激素和抗生素等殘留。雖然QuEChERS方法最初是針對水果和蔬菜中的農(nóng)藥多殘留分析,最近也應(yīng)用于霉菌毒素的檢測。Zhang等[20]采用QuEChERS方法對谷物中的黃曲霉毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素和嘔吐毒素等16種毒素進(jìn)行前處理,UHPLC-MS/MS法檢測,方法的平均回收率為70％ ～120％,檢出限為0.2～29.7μg/kg,部分毒素回收率不高（70％左右）,而且并沒有對鏈格孢霉毒素進(jìn)行檢測。目前還未見相關(guān)柑橘中5種鏈格孢霉毒素的檢測方法的報(bào)道。

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù),建立了快速檢測柑橘中5種鏈格孢霉毒素Ten,ALT,AME,AOH和TeA的方法?？疾炝擞绊懱崛⌒Ч囊蛩?如樣品量、提取溶劑、無水MgSO4的用量、NaCl的用量、是否添加吸附劑和提取時(shí)間等,并將本方法應(yīng)用于實(shí)際樣品測定。結(jié)果表明,本方法具有快速、簡便、重現(xiàn)性良好等優(yōu)點(diǎn),能夠滿足不同柑橘中鏈格孢霉毒素的快速確證檢測的要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與樣品

Waters Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）,配有Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）；KS260搖床（德國IKA公司）；KQ5200DE超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；3K15離心機(jī)（德國Sigma公司）；SANYO MDF-382E（N）超低溫冰箱（日本松下集團(tuán)）；Vortex Genius 3渦旋混合器（德國IKA公司）；Milli-Q A10超純水器（美國Millipore公司）；0.22μm有機(jī)濾膜（中國捷盛依科科技有限公司）。

騰毒素、交鏈格孢酚單甲醚、鏈格孢酚和細(xì)交鏈格孢菌酮酸的標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98％,新加坡Pribolab公司）；交鏈孢烯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98％,加拿大TRC公司）；乙腈、甲醇（色譜純）和N-丙基乙二胺均購自德國CNW Technologies有限公司；無水MgSO4（分析純,江蘇強(qiáng)盛化工有限公司,140℃烘烤4 h）；NaCl（分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,140℃烘烤4 h）；甲酸（分析純,重慶川東化工有限公司）。

臍橙,蘆柑,溫州蜜柑,南豐蜜橘購買于重慶當(dāng)?shù)爻小?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 超高效液相色譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相組成：A（0.1％甲酸溶液）+B（乙腈）；梯度洗脫程序：0～4.3min,5％ ～95％B；4.3～7.0min,95％B；5.0～5.1min,95％～5％B；5.1～6.0min,5％B。進(jìn)樣量：5μL；流速：0.3 mL/min。

2.2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件離子化模式：電噴霧離子源,正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電離電壓3 kV,離子源溫度120℃,脫溶劑溫度380℃,脫溶劑氣流量800 L/h,碰撞氣流量0.18 L/min,錐孔反吹氣流量50 L/h。5種鏈格孢霉毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 5種鏈格孢霉毒素的串聯(lián)質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for the five alternariamycotoxins

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取5種鏈格孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于1 mL乙腈中,配制成各自質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,密封后置于-50℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋配制成1000,500,200,100,50和20μg/L的5種鏈格孢霉毒素的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于-50℃保存。

基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液：以不含鏈格孢霉毒素的柑橘果實(shí)為材料,利用本實(shí)驗(yàn)前處理方法分別制備柑橘果皮、全果和果肉的基質(zhì)空白溶液。分別移取適量的1000,500,200,100,50和20μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用基質(zhì)空白溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度為100,50,20,10,5和2μg/L的基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化后的方法條件下測定,分別得到果皮、全果和果肉中5種毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 樣品前處理方法

樣品前處理方法的改進(jìn)[21,22]：分別稱取柑橘全果、果肉和果皮樣品各5g（精確至0.01g）于50mL尖底具塞離心管中,加入5.00mL1.5％甲酸-乙腈溶液,20℃下恒溫超聲提取30min；再加入2.5g無水MgSO4和0.4gNaCl,劇烈振蕩1min后,在10000r/min下離心5min,取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜,濾液經(jīng)UPLC-ESI-MS/MS分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)研究了乙腈-水,甲醇-水,乙腈-甲酸溶液,乙腈-甲酸銨溶液,甲醇-甲酸溶液5種流動(dòng)相體系,結(jié)果表明,在流動(dòng)相為乙腈-甲酸（甲酸含量0.1％）溶液時(shí),5種鏈格孢霉毒素可以達(dá)到分離,且均能獲得較好的峰型和響應(yīng)值（見圖1）。

圖1 5種鏈格孢霉毒素的MRM離子質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrogram of five alternariamycotoxinsa. Tentoxin； b. Altenuene； c. Alternariol Monomethyl Ether；d.Alternariol；e.Tenuazonic acid.

通過電噴霧電離（ESI）和流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式對多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。分別在電噴霧ESI+和ESI-模式下進(jìn)行全掃描,結(jié)果表明,在ESI+模式下,5種鏈格孢霉毒素靈敏度響應(yīng)值高,母離子分別為m/z 415.19,293.10,273.04,259和198.10。通過對脫溶劑溫度、碰撞壓力、碰撞電壓、毛細(xì)管電壓和錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化,選擇了穩(wěn)定性好、豐度高和干擾小的兩個(gè)碎片離子作為5種毒素定性離子和定量離子,并以豐度最強(qiáng),響應(yīng)值最高的的離子對作為定量離子對（見表1）,圖1為濃度為100μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種鏈格孢霉毒素的MRM定量離子對質(zhì)譜圖。

3.2 改進(jìn)QuEChERS方法萃取條件優(yōu)化

為提高萃取效率,需對QuEChERS方法操作條件進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的過程中樣品均采用全果為基準(zhǔn),加標(biāo)水平均為0.1 mg/kg。

3.2.1 樣品量對5種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化QuEChERS方法普遍采用的稱取樣品量為10g[23～25],本實(shí)驗(yàn)考察了不同樣品量（2,5和10g）對5種鏈格孢霉毒素回收率的影響。結(jié)果表明,在稱樣量為2.0g時(shí),部分毒素回收率不高,其中Ten和ALT僅65％左右,且精密度和重復(fù)性差,5種毒素的RSD在9.6％～15.2％之間,尤其TeA的RSD值高達(dá)15.2％；在5和10g時(shí),5種毒素的回收率都能達(dá)到80％以上,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10％。考慮到樣品量的增加會(huì)使乙腈提取液的量也增加,最終選擇樣品的稱取量為5 g。

3.2.2 提取溶劑對5種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化TeA是一種酸,樣品提取液中加入適量酸有利于TeA提取[26]。本實(shí)驗(yàn)分別以0.1％,0.5％,1.0％,1.5％和2.0％（V/V）甲酸-乙腈為提取液,分別對樣品進(jìn)行提取（圖2）。結(jié)果表明,當(dāng)甲酸含量為0.1％～1.5％時(shí),TeA的回收率顯著上升,其它4種毒素的回收率變化不明顯；在甲酸含量為1.5％時(shí),所有毒素的添加回收率均大于80％；在甲酸含量為1.5％～2.0％時(shí),5種毒素的回收率均下降,其中以TeA下降最明顯。綜合考慮確定甲酸1.5％（V/V）-乙腈作為提取液。

圖2 甲酸含量對5種鏈格孢霉毒素回收率的影響（以全果為基質(zhì),加標(biāo)水平：0.1 mg/kg）Fig.2 Effect of formic acid content on recovery rates of five alternaria mycotoxins（in whole fruit,spiked at 0.1 mg/kg）

3.2.3 提取方式、超聲溫度和功率對5種鏈格孢霉毒素提取效果的影響本實(shí)驗(yàn)考察了超聲波和振蕩及兩者交替3種提取方式對5種鏈格孢霉毒素回收率的影響。結(jié)果表明,在振蕩提取時(shí),AOH和TeA提取回收率低于80％；超聲波提取時(shí),5種毒素的回收率均大于85％；兩者交替與直接超聲提取結(jié)果無顯著差異。因此,最終選擇以超聲提取方式。本實(shí)驗(yàn)還研究了超聲溫度（20℃,30℃和40℃）和超聲功率（90,120和150 W）對5種鏈格孢霉毒素回收率效果的影響,發(fā)現(xiàn)兩者對回收率的影響不顯著。因此,本研究選擇溫度20℃和功率90W作為提取條件。

3.2.4 無水M gSO4、NaCl用量和吸附劑對5種鏈格孢霉毒素提取效果的影響QuEChERS方法中常用的除水劑主要有MgSO4,MgCl2,NaNO3,Na2SO4等,其中以MgSO4的除水效果最好。本實(shí)驗(yàn)考察了無水MgSO4用量（1,1.5,2,2.5,3g）對5種毒素回收率的影響。MgSO4用量為1.0～2.5 g時(shí),3種毒素Ten,ALT和AOH的回收率變化趨勢并不明顯, 而AME和TeA的回收率均上升,并在2.5 g時(shí)回收率均達(dá)到85％以上；MgSO4用量為2.5～3.0 g時(shí), 4種毒素回收率均下降,其中Ten的回收率從95.1％下降到94.6％,變化并不明顯,因此確定無水MgSO4的用量為2.5 g。

樣品經(jīng)過提取后,提取液中仍然存在大量共萃物；添加了鹽析劑后,提取液中的有機(jī)相分子（如：乙腈）會(huì)由于離子強(qiáng)度的增加而斷開與水分子間的氫鍵,從水中鹽析出來。本實(shí)驗(yàn)考察了鹽析劑NaCl用量（0.3,0.4,0.5,0.6,0.7g）對5種毒素回收率的影響,結(jié)果表明,當(dāng)NaCl用量在0.3～0.4g時(shí), 5種鏈格孢霉毒素的回收率達(dá)到85％以上；在0.4～0.7g范圍內(nèi),有4種毒素回收率均下降,因此確定NaCl的用量為0.4g。

圖3 提取時(shí)間對5種鏈格孢霉毒素回收率的影響（以全果為基質(zhì),加標(biāo)水平：0.1 mg/kg）Fig.3 Effect of extraction time on recoveries of five alternariamycotoxins（in whole fruit,spiked at0.1 mg/kg）

當(dāng)樣品提取液經(jīng)鹽析分層后,少量的蛋白質(zhì)、油脂、色素以及糖組分會(huì)不可避免地與真菌毒素共同萃取出來,嚴(yán)重干擾殘留的分析結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)研究了不加吸附劑及分別加入C18,PSA,GCB這3種吸附劑對5種鏈格孢霉毒素回收率的影響,發(fā)現(xiàn)加入PSA后TeA的回收率為50％～60％；加入GCB后 AME的回收率為0；加入C18及不加入任何吸附劑對5種鏈格孢霉毒素的回收率影響不顯著,其中TeA在C18條件下重現(xiàn)性差且不穩(wěn)定,因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇不加入任何吸附劑。

3.2.5 提取時(shí)間的優(yōu)化考察了提取時(shí)間（10, 20,30,40,50和60min）對5種鏈格孢霉毒素回收率的影響（圖3）。在10～30min時(shí),5種毒素回收率均上升,達(dá)80％以上；在30～60min時(shí),4種毒素的回收率無顯著差異,而AOH的回收率顯著下降。在基質(zhì)標(biāo)測定時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著空白基質(zhì)溶液加入的比例的增加,AOH的基質(zhì)減弱效應(yīng)逐步增強(qiáng)；而在提取時(shí)間優(yōu)化時(shí),隨著超聲時(shí)間的過度延長,AOH的響應(yīng)值明顯下降,其基質(zhì)減弱響應(yīng)明顯增強(qiáng),回收率也逐漸下降至70％左右,因此推測過度的延長超聲時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品雜質(zhì)的溶出量增加,對AOH的檢測產(chǎn)生一定干擾。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect,ME）是指樣品中除目標(biāo)化合物以外的其它成分對目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響[27]。為了檢驗(yàn)空白樣品基質(zhì)對目標(biāo)化合物的響應(yīng)值是增強(qiáng)還是抑制,分別用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)空白溶液配置100μg/L的5種鏈格孢霉毒素的混合溶液,并進(jìn)行比較,當(dāng)平均基質(zhì)效應(yīng)（增強(qiáng)或抑制）超過20％,則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對定量檢測具有顯著影響,不可忽略。基質(zhì)效應(yīng)（ME）可以通過下面的公式計(jì)算：

式中,A1為特定濃度下的毒素標(biāo)準(zhǔn)品在純?nèi)軇ǔ跏剂鲃?dòng)相）中的平均峰面積；A2為相同濃度下的毒素標(biāo)準(zhǔn)品在基質(zhì)空白溶液中的平均峰面積。

表2 柑橘樣品果皮、果肉、全果通過QuEChERS方法前處理后的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Overview of matrix effects evaluated in peel,pulp and whole fruit when employing the QuEChERS-based sample preparation approach（UPLC/ESI+-MSanalysis）

表2表明,5種毒素的基質(zhì)效應(yīng)都是減弱效應(yīng),絕對值均幾乎大于20％,其中在果皮中的減弱效應(yīng)最高,果肉中最低,分析原因是柑橘果皮基質(zhì)比較復(fù)雜,而果肉基質(zhì)簡單,因此基質(zhì)效應(yīng)會(huì)降低方法的靈敏度,影響方法的準(zhǔn)確性。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液為基準(zhǔn)來進(jìn)行校正。

3.4 方法的評(píng)價(jià)

3.4.1 線性關(guān)系和檢出限在優(yōu)化的前處理和色譜條件下,對系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)空白混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測,其線性范圍和精密度結(jié)果見表3。結(jié)果表明,5種鏈格孢霉毒素在2.0～100μg/L范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系,R2＞0.9922。在S/N=3時(shí), Ten,ALT,AME,AOH和TeA的檢出限在0.11～0.91μg/kg范圍內(nèi)。

表3 5種鏈格孢霉毒素的線性范圍、線性方程、R2和檢出限（LODs）Table 3 Liner range,linear equation,R2and limit of detection（LODs）of five alternariamycotoxins

3.4.2 加標(biāo)回收率和精密度分別在5,20和100μg/kg水平下加標(biāo),每個(gè)水平重復(fù)測定5次。5種毒素的回收率在71％～112％之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10％（見表4）,結(jié)果表明,本方法對柑橘樣品的不同含量的5種鏈格孢霉毒素的測定均具有較高的回收率和精密度,滿足檢測要求。

3.4.3 實(shí)際樣品測定在本地市場隨機(jī)抽取寬皮柑橘（南豐蜜橘、溫州蜜柑和蘆柑）和橙類（臍橙）各20個(gè),共計(jì)80份,采用本方法分別對4個(gè)不同品種柑橘的果皮、果肉和全果進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,其中20份柑橘果皮樣品呈陽性,主要集中在南豐蜜橘和溫州蜜柑里,而5種鏈格孢霉毒素的含量在2.1～21.8μg/kg范圍；14份柑橘全果樣品呈陽性,5種毒素均有檢出,含量在2.0～10.2μg/kg范圍；3份柑橘果肉樣品呈陽性,主要檢出了ALT和AOH兩種毒素,毒素含量在3.3～5.0μg/kg。由表5可知,鏈格孢霉毒素主要產(chǎn)生在果皮上,而后通過果皮侵染,這與Magnani等[8]的研究結(jié)果一致。

表4 柑橘的果皮、果肉以及全果中5種鏈格孢霉毒素的添加回收率和精密度（n=5）Table 4 Recoveries and precisions for the five alternariamycotoxins in citrus peel,pulp and whole fruit（n=5）

表5 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果Table 5 Detecting results of real samples

4 結(jié)論

利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù),建立了快速檢測柑橘中Ten,ALT, AME,AOH和TeA 5種鏈格孢霉毒素的方法。采用改進(jìn)的QuEChERS一步提取凈化的前處理方法處理柑橘樣品,重點(diǎn)考察了影響提取效果的因素,如樣品量、提取溶劑、無水MgSO4用量、NaCl用量、是否添加吸附劑和提取時(shí)間等,同時(shí)簡化了前處理步驟。本方法具有操作簡單、快速、靈敏度高、檢出限低和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),能滿足柑橘中真菌毒素的檢測要求。

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（Received 5 May 2015；accepted 22 July 2015）

Rapid Determ ination of Five Alternaria M ycotoxins in Citrus by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem M ass Spectrometry

JIANG Li-Yan1,2,ZHAO Qi-Yang2,4,GONG Lei2,4,LIU Yan-Yu2,4,ZHANG Yao-Hai2,4,
MA Liang*1,2,JIAO Bi-Ning*1,2,3,41（College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China）
2（Citrus Research Institute,Southwest University/Laboratory ofCitrus Quality and Safety Risk Assessment, Ministry ofAgriculture,Chongqing 400712,China）
3（National Center for Citrus Engineering,Chongqing 400712,China）
4（Supervision and Testing Centre for Citrus and Seedling Quality, Ministry ofAgriculture,Chongqing 400712,China）

A novel method was developed for the rapid determination of five alternaria mycotoxins, alternariol,alternariolmonomethyl ether,altenuene,tentoxin and tenuazonic acid,in citrus using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The sample was prepared using the modified QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rigged,and safe）method to complete the extraction and cleanup steps in one procedure.In this QuEChERSmethod,sample was extracted with acetonitrile（1.5％formic acid）,then salted out with anhydrous MgSO4 and NaCl,separated on an ACQUITY UPLC BEH C18with gradient elution by using acetonitrile and 0.1％formic acid aqueous as eluant,and detected by UPLC-MS/MS under negative（ESI+）electrospray ionization and MRM models.Under these conditions,five alternaria mycotoxinsmade a good linearity in the concentration range of2.0-100μg/L with R2＞0.9922,and the limits of detection of the instrument were in the range of 0.11-0.91μg/kg.Three spiked levels of five altenaria mycotoxins at5,20 and 100μg/kg were investigated,and the recoveries ranged from 71％to 112％with the relative standard deviations（RSDs）varying from 1.1％to 9.9％,which met the requirement ofmycotoxins determination.

Altenariamycotoxins；Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Citrius；QuEChERSmethod

10.11895/j.issn.0253-3820.150370

2015-05-05收稿；2015-07-22接受

本文系國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（No.2013CB127803）、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31301476）、農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑桔）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-27）、2015年國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)（GJFP2015004）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2013B035）資助項(xiàng)目。

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