基于聚吡咯-銦錫氧化物微電極的細胞阻抗生物傳感器構(gòu)建及細胞生物學(xué)行為信息檢測

李遠袁國林夏春勇于超（重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,重慶40006）（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院,永川4060）

基于聚吡咯-銦錫氧化物微電極的細胞阻抗生物傳感器構(gòu)建及細胞生物學(xué)行為信息檢測

李遠1,2袁國林1夏春勇1于超*11（重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,重慶400016）2（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院,永川402160）

采用光刻技術(shù)蝕刻感光干膜絕緣層制備銦錫氧化物（ITO）微電極,采用循環(huán)伏安法在ITO微電極表面電沉積聚吡咯（PPy）膜制備PPy-ITO微電極。用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)考察PPy膜厚度對PPy-ITO微電極阻抗特征的影響,人肺癌細胞株A549粘附增殖實驗考察PPy-ITO電極細胞生物相容性。以PPy-ITO微電極為傳感電極,通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)和等效電路擬合技術(shù)對A549細胞粘附增殖及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）過程進行檢測和分析。結(jié)果表明,與裸ITO微電極相比,在最優(yōu)參數(shù)下制備的PPy-ITO微電極（電沉積5個循環(huán)）具有更優(yōu)的電化學(xué)阻抗性質(zhì)和細胞生物相容性?；赑Py-ITO微電極的細胞阻抗生物傳感器能夠解析A549細胞粘附增殖及EMT過程中細胞質(zhì)膜電容、細胞-細胞間隙電阻、細胞-聚吡咯膜間隙電阻變化檢測。

生物傳感器；電化學(xué)阻抗譜；聚吡咯；銦錫氧化物

1 引 言

細胞阻抗生物傳感器是一類以固定在電極表面的活細胞作為敏感原件,以電化學(xué)阻抗譜檢測細胞響應(yīng)行為的生物傳感器[1]。由于細胞阻抗生物傳感器能夠無標(biāo)記、定量地分析細胞粘附、增殖、凋亡等生物學(xué)行為[2～4],在藥物篩選[5]、毒物測試[6]及細胞生理病理機制研究[7]等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。在細胞阻抗生物傳感器研究中,電極表面的細胞固定與活性保持是細胞對外界刺激響應(yīng)的基礎(chǔ),因此構(gòu)建兼具細胞生物相容性和導(dǎo)電性的傳感電極是其研究的關(guān)鍵。

當(dāng)前,細胞阻抗生物傳感器的傳感電極常采用惰性金屬導(dǎo)電材料,如金[8]、鉑[9]或銦錫氧化物[10],生物相容性較差,采用新型生物材料進行表面修飾是改善電極細胞生物相容性的重要方法[11]。聚吡咯作為一種共軛導(dǎo)電聚合物,具有本征導(dǎo)電性、表面性質(zhì)可控、穩(wěn)定性好及低電位聚合制備等優(yōu)點,可作為電化學(xué)生物傳感器[12]的電極修飾材料。此外,聚吡咯膜還是一種重要的組織工程材料[13]和神經(jīng)探針電極修飾材料[14],可為神經(jīng)細胞[15]、內(nèi)皮細胞[16]、心肌細胞[17]等提供粘附與增殖位點。Ding等在ITO電極表面修飾了碳納米管摻雜的聚吡咯納米復(fù)合膜,證實該復(fù)合物界面適宜細胞粘附和增殖,通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)檢測了ECA-109細胞的粘附和增殖[18]。Ateh等利用聚吡咯修飾的金電極進行細胞阻抗檢測,結(jié)果表明,聚吡咯修飾電極能夠提高傳感器檢測靈敏度[19]。然而,上述報道的細胞阻抗生物傳感器采用大尺寸傳感電極,通過檢測溶液中氧化還原探針電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化實現(xiàn)電極表面上細胞數(shù)量的檢測,未能進一步分析細胞生物學(xué)過程行為學(xué)信息。本研究構(gòu)建了ITO微電極,研究了聚吡咯修飾在改善電極本征阻抗特征和細胞生物相容性方面的作用。以PPy-ITO微電極為傳感電極,在無氧化還原探針情況下通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)對人肺癌細胞株A549粘附增殖和EMT過程進行檢測,利用等效電路擬合技術(shù)解析上述過程中細胞質(zhì)膜電容、細胞-細胞間隙電阻、細胞-聚吡咯膜間隙電阻的變化。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CS315電化學(xué)工作站（武漢科斯特儀器有限公司）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；Veeco MultimodeⅧ原子力顯微鏡（瑞士Veeco公司）；IX71倒置光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司）。ITO導(dǎo)電玻璃（珠海凱為光電科技有限公司）,面電阻≤7Ω/mm2,用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗15min,烘干待用。HF90二氧公碳細胞培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技集團）；離心機（德國Eppendorf公司）。

吡咯單體（Sigma-Aldrich公司）,氮氣保護蒸餾,-20℃儲存；硫酸葡聚糖（Dextran Sulfate,DS,Sigma-Aldrich公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1,以色列Prospec公司）。其它試劑均為分析純。實驗用水為去離子水（≥18 MΩcm）。CCK-8分析液、異硫氰酸熒光素標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（江蘇省海門碧云天生物技術(shù)公司）。人肺癌上皮細胞A549在含10％胎牛血清（杭州四季青）、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)液（Gibco）中,37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)；待細胞生長至對數(shù)生長期,用0.25％胰酶（含0.02％EDTA）消化細胞,1500 r/min離心4min,收集細胞。

2.2 ITO微電極加工及聚吡咯膜電化學(xué)沉積

ITO微電極采用光刻技術(shù)對感光干膜絕緣層蝕刻而成：將一層感光干膜（HQ-6100,感光層厚度為35μm,長興化學(xué)工業(yè)股份有限公司）通過覆膜機 （100℃）壓貼在ITO導(dǎo)電玻璃表面（6.0 cm× 2.5 cm）,透過掩膜膠片對感光干膜紫外光照射30 s,30℃下用1％Na2CO3溶液對感光干膜顯影5min,使未經(jīng)紫外光照射區(qū)域的感光干膜溶解露出ITO電極,去離子水沖洗2次,60℃烘干,紫外光照射60 s,使感光膠完全固化。ITO微電極直徑為1.0 mm,如圖1a所示。

電化學(xué)小池裝置結(jié)構(gòu)示意圖如圖1b所示,ITO微電極和測量小池用塑料夾具固定,使ITO微電極置于測量小池底部,整個裝置含4個獨立的測量小池,每個小池直徑為8mm,體積為500μL。聚吡咯膜電沉積采用電化學(xué)循環(huán)伏安法,以ITO微電極為工作電極,以Ag/AgCl絲（10 mm×0.5 mm）和鉑絲（10 mm×0.1 mm）分別作為參比電極和輔助電極,如圖1c所示。聚合溶液含0.1 mol/L吡咯單體和1mg/mL硫酸葡聚糖（DS）,聚合電壓設(shè)為0～0.7 V（vs.Ag/AgCl）,掃描速度20 mV/s,膜厚度通過循環(huán)數(shù)控制。用原子力顯微鏡對聚吡咯模形貌進行表征。

圖1 氧化銦錫（ITO）微電極（a）,和電化學(xué)測量池裝置結(jié)構(gòu)示意圖（b）、實物圖（c）Fig.1 Indium tin oxide（ITO）microelectrode（a）,structure diagram（b）,picture of electrochemical cells（c）

2.3 聚吡咯膜細胞生物相容性研究

ITO電極上電沉積的聚吡咯膜細胞的生物相容性通過細胞粘附與增殖行為進行評價。按上述相同聚合參數(shù),在直徑6 mm ITO電極上沉積聚吡咯膜,70％乙醇浸泡30min消毒,無菌去離子水沖洗,干燥待用。將100μL A549細胞懸液以濃度為5.0×104cells/mL接種在電化學(xué)測量小池內(nèi),放入細胞培養(yǎng)箱,靜置2 h,使細胞在小池底部聚吡咯表面粘附與鋪展。以裸ITO電極、玻璃和細胞培養(yǎng)皿材料聚苯乙烯做對照實驗。細胞顯微形態(tài)學(xué)通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察,CCD相機獲取細胞粘附和鋪展的相差顯微圖像。

細胞在聚吡咯膜上的增殖行為通過Cell Counting Kit（CCK-8）實驗評價。將100μL A549細胞懸液（2.0×104cells/mL）分別接種在含聚吡咯膜的測量小池和傳統(tǒng)聚苯乙烯96孔板內(nèi),細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24和48 h,隨后加入10μL CCK-8分析液,輕搖混勻,37℃孵育2 h,分別取測量小池和96孔板內(nèi)溶液100μL,用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

2.4 PPy-ITO微電極上細胞粘附增殖生物學(xué)行為電化學(xué)阻抗檢測

將100μL A549細胞懸液以濃度為2.0×104cells/mL加載到PPy-ITO微電極的測量小池內(nèi),室溫條件下靜置30min,使細胞均勻沉降到PPy-ITO微電極表面,隨后放入細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2,24和48 h,PBS沖洗除去死細胞及未粘附細胞,隨后將輔助電極和參比電極插入測量小池進行電化學(xué)阻抗譜測量。實驗以未加載細胞的PPy-ITO微電極作為對照組。電化學(xué)阻抗譜測量以0.01mol/L PBS作為支持電解質(zhì)溶液,開路電壓下對電極施加幅值為10 mV的正弦波交流檢測信號,頻率掃描范圍為1～105Hz,阻抗譜數(shù)據(jù)用ZView 2.0軟件（Scribner Associates,Southern Pines,NC,USA）建立等效電路擬合分析。

2.5 TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EM T）生物學(xué)行為電化學(xué)阻抗分析

將100μL 1.0×106cells/mL A549細胞懸液加載到含PPy-ITO傳感電極的測量池內(nèi),室溫下靜置30min,放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,A549細胞在傳感電極上增殖形成細胞單層。再將測量小池內(nèi)細胞培養(yǎng)液換成含10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）培養(yǎng)液,以未加入TGF-β1的培養(yǎng)液為對照,分別培養(yǎng)12,24和36 h后測量電化學(xué)阻抗譜。A549細胞骨架用異硫氰酸熒光素標(biāo)記鬼筆環(huán)肽進行熒光染色。

3 結(jié)果與討論

3.1 PPy-ITO微電極加工

電化學(xué)循環(huán)伏安法聚合聚吡咯膜的循環(huán)伏安曲線如圖2a所示。隨著掃描圈數(shù)增加,氧化電流增大,說明聚吡咯膜成功沉積在ITO微電極表面,且提高了電極的導(dǎo)電性和電化學(xué)活性。圖2b為電沉積5個循環(huán)的聚吡咯膜AFM圖像,可以看出電沉積在ITO微電極表面的聚吡咯膜由直徑約為50 nm均勻粒子組成,表面粗糙度為（12.54±0.36）nm（n=3）。

圖2 ITO微電極表面上電化學(xué)循環(huán)伏安法沉積聚吡咯膜.（a）循環(huán)伏安曲線.（b）聚吡咯膜AFM圖片F(xiàn)ig.2 Electropolymerization of polypyrrole（PPy）on the surface of ITO microelectrode by electrochemical cyclic voltammetry.（a）Cyclic voltammogram.（b）AFM image of PPy film

3.2 PPy-ITO微電極電阻抗特性表征及PPy膜厚度優(yōu)化

圖3a為ITO微電極和PPy-ITO微電極電化學(xué)阻抗譜。在1～103Hz掃描頻率范圍間,PPy-ITO微電極阻抗幅值低于ITO微電極阻抗幅值,其原因在于聚吡咯膜電沉積,使電極表面粗糙度和表面積增加,表面雙分子層電容增大,電極阻抗值降低[20]。在1～104Hz掃描頻率范圍,PPy-ITO微電極相位角低于ITO微電極,說明PPy-ITO微電極比ITO微電極更趨向電阻性質(zhì)。其原因在于聚吡咯表面粗糙,且包含大量的空隙,電解質(zhì)滲入空隙內(nèi),使得電極具電阻特征[20]。PPy-ITO微電極的低阻抗幅值和電阻特征有利于提高傳感器檢測靈敏度[21]。圖3b為沉積不同循環(huán)圈數(shù)PPy-ITO微電極阻抗幅值頻率曲線。結(jié)果表明,PPy-ITO微電極阻抗隨電沉積循環(huán)圈數(shù)增加而降低。此結(jié)果與文獻[20]報道的電極阻抗隨聚吡咯聚合時間延長而降低的結(jié)論一致。圖3c為電沉積不同循環(huán)數(shù)的PPy-ITO微電極放大圖像,可見聚吡咯膜均勻沉積在ITO微電極表面,且隨著電沉積循環(huán)次數(shù)增加,聚吡咯膜厚度增大,顏色變深。當(dāng)電沉積循環(huán)圈數(shù)增加至6及以上,聚吡咯膜表面張力增大,容易發(fā)生褶皺,并從ITO微電極上脫落。因此,后續(xù)實驗選擇電沉積循環(huán)5圈制備PPy-ITO微電極。

3.3 PPy-ITO電極細胞生物相容性評價

由不同基底上接種A549細胞2 h后細胞粘附和鋪展的顯微形態(tài)圖片（圖4a）可見,聚吡咯膜上粘附的A549細胞均開始鋪展,而ITO電極表面和玻璃表面的A549細胞仍呈圓形,幾乎不見鋪展的細胞。同時,聚苯乙烯表面上A549細胞也開始鋪展,但鋪展細胞比例小于聚吡咯膜。上述結(jié)果說明,PPy-ITO電極更有效地促進A549細胞的粘附和鋪展,有利于細胞在電極表面固定。圖4b為在PPy-ITO電極表面培養(yǎng)24和48 h時A549細胞的相對增殖率。結(jié)果表明,在PPy-ITO電極表面培養(yǎng)的細胞相對增殖率高于聚苯乙烯基底,這也說明PPy-ITO電極能促進A549細胞增殖,具有優(yōu)異的細胞生物相容性。

圖3 （a）ITO微電極和PPy-ITO微電極電化學(xué)阻抗譜.（b）聚合循環(huán)數(shù)分別為1～10時的PPy-ITO微電極的阻抗頻率曲線.（c）PPy-ITO微電極顯微圖像Fig.3 （a）Electrochemical impedance spectra of ITO and PPy-ITO microelectrodes.Impedance spectrocopy （b）and microscopy images（c）of PPy-ITOmicroelectrodeswith different electrodepositon cycle numbers from one to ten

圖4 PPy-ITO電極細胞生物相容性評價.（a）A549細胞接種2 h時的相差顯微鏡圖像.（b）A549細胞在PPy-ITO電極上相對細胞增殖活性.實驗以聚苯乙烯基底上接種A549細胞24 h時活性作為對照。Fig.4 Cell biocompatibility evaluation of PPy-ITO electrode.（a）Phase contrastmicroscopy images of A549 cells after inoculated for 2 h.（b）Relative viability of A549 cells cultured on PPy-ITO.The viability of A549 cells after cultured on polystyrene substrate for 24 h was used as control

3.4 PPy-ITO微電極上細胞粘附增殖行為的電化學(xué)阻抗譜表征

由A549細胞接種在PPy-ITO微電極上不同時刻對應(yīng)的電化學(xué)阻抗譜復(fù)平面圖（圖5a）可見,A549細胞在PPy-ITO微電極上的粘附和增殖導(dǎo)致電極阻抗譜高頻部分的半圓特征發(fā)生改變,且隨著細胞增殖,半圓直徑增大,說明電極界面上的細胞增殖導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移過程速度減慢,其原因可能與細胞質(zhì)膜電容充電效應(yīng)有關(guān)[19]。另外,在低頻區(qū)域,A549細胞的增殖未對電極阻抗譜產(chǎn)生明顯變化。圖5b為對照PPy-ITO微電極的阻抗譜復(fù)平面圖,其高頻區(qū)域半圓特征未發(fā)生明顯改變。上述結(jié)果說明了圖5a中高頻區(qū)半圓直徑的變化是由細胞粘附與增殖引起的。

PPy-ITO微電極等效電路模型采用含Warburg元件和常相位元件（CPE）的Randles電路[22],利用該電路對0h的PPy-ITO微電極阻抗譜進行非線性最小二乘曲線擬合,獲得PPy-ITO微電極等效電路模型中各元件初始值（圖5c）。細胞等效電路由一個RC并聯(lián)電路和一個R元件串聯(lián)組成[22]。其中,Rs′為細胞-電極的間隙電阻,Rcell為細胞-細胞電阻,Ccell為細胞質(zhì)膜的電容效應(yīng)。將圖5a的電化學(xué)阻抗譜數(shù)據(jù)與圖5c的等效電路模型擬合,細胞增殖不同時刻的等效電路各元件擬合結(jié)果如圖5d所示。結(jié)果表明,Ccell在2～24 h快速增加,24 h后趨于穩(wěn)定,約為8.7 nF,此數(shù)值變化與細胞粘附增殖過程中細胞厚度降低、鋪展面積增大、細胞離子通道數(shù)量和開閉有關(guān)[23]。此外,細胞的Rcell值和Rs′值均持續(xù)增加,形成細胞單層時（48 h）,Rcell≈1655Ω,Rs′≈268Ω。Rcell值持續(xù)增加說明細胞-細胞間的間隙逐漸縮小,細胞融合度增加[24]；Rs′值增加則提示細胞與PPy-ITO電極間間隙縮小,細胞粘附強度增強[24]。

圖5 PPy-ITO微電極上細胞粘附增殖行為的電化學(xué)阻抗譜檢測。（a）接種A549細胞0,2,24和48 h 時PPy-ITO微電極典型的阻抗譜復(fù)數(shù)平面圖；（b）未接種細胞的PPy-ITO微電極典型阻抗譜復(fù)數(shù)平面圖；（c）PPy-ITO微電極等效電路模型（左）和細胞等效電路模型（右）串聯(lián)；（d）PPy-ITO微電極上接種A549細胞不同時刻的細胞等效電路模型各元件值擬合值（n=3）Fig.5 Cell adhesion and proliferation behaviors on PPy-ITO microelectrode measured by electrochemical impedance spectroscopy.（a）Typical electrochemical impedance spectra of PPy-ITO microelectrodes recorded at0,2,24 and 48 h after inoculation of A549 cells；（b）Typical electrochemical impedance spectra of PPy-ITOmicroelectrodeswithout cells inoculation；（c）Equivalent circuitmodel of PPy-ITO microelectrode（left）and Equivalent circuitmodel of cell（right）in series；（d）Curve fit results for the equivalent circuitmodel of A549 cells after inoculation on PPy-ITOmicroelectrodes at different time interval（n=3）

3.5 PPy-ITO微電極測量TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EM T）生物學(xué)過程

圖6a為TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞36h后細胞骨架熒光染色圖像。結(jié)果顯示,對照組A549細胞呈典型的鵝卵石樣上皮形貌,而實驗組A549細胞形態(tài)更趨向呈纖維梭狀細胞樣,細胞間連接變?nèi)?應(yīng)力纖維增加。此結(jié)果與文獻[25]相符,證實A549細胞在TGF-β1誘導(dǎo)作用下成功發(fā)生EMT過程。圖6b為A549細胞EMT過程中不同時間點細胞等效電路元件值變化曲線,TGF-β1處理12 h時,實驗組Ccell低于對照組Ccell；在24和36 h時,實驗組Ccell高于對照組Ccell,證明腫瘤細胞EMT過程中出現(xiàn)的細胞膜波動、細胞面積增大和細胞應(yīng)力纖維增加等形態(tài)學(xué)變化[25]。此外,實驗組Rs′和Rcell值均比對照組Rs′和Rcell值低,且隨著TGF-β1處理時間延長,差值增大。實驗組Rs′降低提示細胞與基底間間隙增大,粘附力減低,此結(jié)果與文獻[26]的實驗結(jié)果（細胞EMT過程細胞與基底間粘附力降低）吻合。Rcell值降低則提示細胞-細胞間連接變?nèi)?這與A549細胞EMT過程細胞連接蛋白E-鈣黏著蛋白表達減低有關(guān)[25]。

圖6 （a）A549細胞的細胞骨架熒光染色圖片.（b）TGF-β1處理A549細胞不同時刻細胞等效電路模型各元件值擬合值（n=3）Fig.6 （a）Cytoskeletion fluorescence images of A549 cells.（b）Curve fit results for the equivalent circuit model of A549 cell after treatmentwith TGF-β1 for different time

4 結(jié)論

采用光刻技術(shù)制備ITO微電極,在ITO微電極表面電沉積PPy膜制備PPy-ITO微電極。通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)和等效電路擬合技術(shù)對微電極表面上的A549細胞粘附增殖及EMT過程進行檢測分析。結(jié)果表明,PPy-ITO微電極具有優(yōu)良的電化學(xué)阻抗特性和細胞生物相容性,基于此電極構(gòu)建的阻抗生物傳感器可對細胞生物學(xué)行為信息進行檢測。

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（Received 14 May 2015；accepted 25 August2015）

This work was supported by the Natural Science Foundation Project of CQ CSTC（cstc2012jjA10046）,Innovation Ability Platform Project of Yongchuan District（Ycstc,2014bf5001）and the Key Research Project of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University（YJZD201302）

Construction of a Cell Im pedance Biosensor Based on Polypyrrole-Indium Tin Oxide M icro-Electrode for Detecting Cell Biology Behavior

LIYuan1,2,YUAN Guo-Lin1,XIA Chun-Yong1,YU Chao*11（Institute of Life Sciences,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China）
2（Central Laboratory of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University,Yongchuan 402160,China）

An indium tin oxide（ITO）microelectrode was fabricated by etching the insulating layer of photosensitive dry film using lithography technology,then polypyrrole（PPy）layer with different thicknesswas electrodeposited on the surface of the ITOmicroelectrode by electrochemical cyclic voltammetry to get PPy-ITO microelectrode.The effect of the thickness of PPy layer on the impedance characteristic of PPy-ITO microelectrode was examined by electrochemical impedance spectroscopy（EIS）.The biocompatibility of the PPy-ITOmicroelectrodeswas investigated by adhesion and proliferation experiment of human lung cancer cell A549.Finally,using PPy-ITO microelectrode as sensing electrode,biology information on the adhesion, proliferation and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549 was tested and analyzed by EIS and equivalent circuit fitting.The results showed that the PPy-ITO microelectrode prepared under optimal parameter（electrodeposition for five cycles）had a lower electrical impedance and a better cell compatibility than bare ITOmicroelectrode.The changes of cytoplasm membrane capacitance,intercellular resistance and the gap resistance between cell and polypyrrole film during the processes of adhesion,proliferation and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549 could be detected by a cell impedance biosensor based on the PPy-ITOmicroelectrode.

Biosensor；Electrochemical impedance spectroscopy；Polypyrrole；Indium tin oxide

10.11895/j.issn.0253-3820.150396

2015-05-14收稿；2015-08-25接受

本文系重慶市科委自然科學(xué)基金計劃資助項目（cstc2012jjA10046）；重慶市永川區(qū)創(chuàng)新能力建設(shè)平臺項目（Ycstc,2014bf5001）；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院院級重點研究項目（YJZD201302）資助

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