過氧化氫與L-半胱氨酸對BSA-Cu體系熒光“開-關”響應及分析應用

廖小晴王會影李在均,（江南大學化學與材料工程學院,食品膠體與生物技術教育部重點實驗室,無錫4）

過氧化氫與L-半胱氨酸對BSA-Cu體系熒光“開-關”響應及分析應用

廖小晴1王會影1李在均*1,2
（江南大學化學與材料工程學院1,食品膠體與生物技術教育部重點實驗室2,無錫214122）

在堿性條件下,牛血清白蛋白（BSA）與銅離子（Cu2+）形成穩(wěn)定的BSA-Cu配合物,加入H2O2可顯著加快銅納米簇的形成,導致體系熒光強度迅速增加。本研究基于對BSA-Cu體系的熒光“開-關”響應,建立了測定H2O2的熒光動力學分析方法。H2O2濃度在1.0×10-6～1.5×10-3mol/L之間,熒光強度的增加與H2O2濃度呈現(xiàn)良好的線性關系,方法的檢出限達到3.1×10-7mol/L（S/N=3）；收集檢測完H2O2的銅溶液,室溫放置,使Cu2+完全轉化為銅納米簇,體系熒光強度逐步增加到最大,加入L-半胱氨酸產(chǎn)生熒光猝滅?；趯SA-Cu體系的熒光“關”響應,建立了測定L-半胱氨酸的熒光分析方法。當L-半胱氨酸濃度在2.0×10-4～1.0×10-2mol/L范圍,熒光強度隨 L-半胱氨酸濃度的增加而線性下降,方法檢出限為 5.7×10-5mol/L （S/N=3）；廢液經(jīng)高溫灰化和稀H2SO4溶解,可實現(xiàn)銅簇向Cu2+的轉化,然后再按本方法進行H2O2與L-半胱氨酸的測定。利用Cu2+與銅納米簇之間相互轉化,可實現(xiàn)H2O2和L-半胱氨酸連續(xù)檢測的循環(huán)和銅的重復利用。本方法具有靈敏、低成本和環(huán)保等優(yōu)勢,可廣泛應用于H2O2和L-半胱氨酸的日常分析。

銅離子；銅納米簇；熒光探針；過氧化氫；L-半胱氨酸

1 引 言

金屬納米簇是由幾十到幾百個原子組成的新型納米材料。不同于金屬原子、金屬納米粒子和金屬單質(zhì),金屬納米簇尺寸接近電子的費米波長,可產(chǎn)生不連續(xù)的電子能級,表現(xiàn)出獨特的光學、電學及化學性質(zhì)[1,2]。相對于半導體量子點[3]和有機熒光染料[4],金屬納米簇不僅可產(chǎn)生尺寸依賴且可調(diào)的熒光,還有許多其它優(yōu)良性能。例如,斯托克位移較大、熒光量子效率高和生物相容性好。目前,金屬納米簇已廣泛應用于熒光檢測、細胞成像和生物標記等領域[5～7]。

銅在電導率和成本方面優(yōu)于貴金屬,銅納米簇的合成與應用近年受到關注。然而,銅化學活性高,對空氣和水都不穩(wěn)定,導致水溶性銅納米簇的制備比貴金屬納米簇更為困難。研究表明,穩(wěn)定劑是影響銅納米簇的形成及光學性能的重要因素。目前,用于水溶性銅納米簇合成的穩(wěn)定劑有聚乙烯亞胺[8]、組氨酸[9]、半胱氨酸[10]、青霉胺[11]、谷胱甘肽[12]、DNA[13,14]、牛血清白蛋白（BSA）[15,16]、溶菌酶[17]、胰蛋白酶[18]和轉鐵蛋白[19]等。其中,以BSA最為常用[20]。BSA含有583個氨基酸殘基、由35個半胱氨酸組成的17個二硫鍵和1個游離巰基。游離巰基的存在使BSA具有一定還原能力,因此BSA在銅納米簇制備同時起到穩(wěn)定劑、螯合劑和還原劑的作用。由于銅的標準電極電勢低于金和銀,BSA還原Cu2+生成Cu0的反應速度慢,使銅納米簇的制備需要較長的時間。此外,制備的銅納米簇中存在較高濃度的Cu2+,限制了它在生物、醫(yī)學等領域的直接應用。最近,研究人員嘗試引入水合肼等較強還原劑制備水溶性銅納米簇,但效果并不理想[21]。

本研究以BSA作為穩(wěn)定劑制備水溶性銅納米簇,并對其動力學過程進行研究,發(fā)現(xiàn)H2O2對銅納米簇的形成具有顯著催化作用。基于H2O2和L-半胱氨酸對BSA-Cu體系熒光“開-關”響應,建立了定量檢測H2O2和L-半胱氨酸的熒光分析方法。本方法具有快速、靈敏、成本低和環(huán)保的特征,已成功應用于藥物樣品中H2O2和L-半胱氨酸的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cary Esclipse熒光光度計（美國瓦里安公司）；TU-1901雙光束紫外-可見分光光計（北京普析通用儀器有限責任公司）；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；MOS-450圓二色光譜儀（法國Bio-Logic公司）；Zeta PALSZeta電位及納米粒度分析儀（美國布魯克海文公司）；Lab Dancer漩渦振蕩器（德國IKA公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海驥輝分析儀器有限公司）。

牛血清白蛋白（BSA）、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、H2O2（30％）、酒石酸鉀鈉和L-半胱氨酸純度至少為分析純,均購于國藥集團化學試劑公司。BSA溶液：1.5 g BSA溶于100 mL水。Cu2+溶液：將0.22g CuSO4·5H2O和0.42 g酒石酸鉀鈉溶于100 mL水中,然后用1.0 mol/L NaOH調(diào)至pH 12。H2O2溶液：移取1.0 mL 30％H2O2,加水稀釋并定容至250 mL,采用高錳酸鉀滴定法測定準確濃度。吸取適量此溶液,用水稀釋至所需要的濃度。L-半胱氨酸溶液：0.121g L-半胱氨酸溶于100 mL水。0.01 mol/L PBS緩沖溶液（Na2HPO4-KH2PO4-NaCl-KCl,pH 7.4）。實驗用水均為二次蒸餾水（一次蒸餾水經(jīng)石英亞沸蒸餾器蒸餾制得）。

2.2 H2O2的測定

移取1.0 mL BSA溶液于5 mL離心管,加入0.5 mL Cu2+溶液,振蕩5 s,加入不同體積的H2O2溶液,用水定容至2.0 mL,振蕩5 s,于45℃的恒溫水浴中保溫5min,然后分別以320和420 nm作為激發(fā)波長和發(fā)射波長,在熒光分光度計上測定熒光強度或進行光譜掃描。

2.3 L-半胱氨酸的測定

移取0.4mL PBS緩沖溶液于5 mL離心管中,加入0.25 mL銅納米簇溶液,振蕩5s,加入不同體積的L-半胱氨酸溶液,用水定容至1.0 mL,振蕩5 s,室溫放置30min,然后分別以320和420 nm作為激發(fā)波長和發(fā)射波長,在熒光分光度計上測定熒光強度或進行光譜掃描。

2.4 Cu0與Cu2+的轉化

收集檢測L-半胱氨酸后的含銅廢液,加熱除去水分。將殘渣轉移至鉑鉗鍋,然后放入馬弗爐,以5℃/min速率升溫至650℃,保溫至樣品中黑色的碳完全消失為止。取出鉗鍋,冷卻,最后用2 mol/L H2SO4溶解得到CuSO4溶液。

3 結果與討論

3.1 BSA-Cu配合物的形成

通常,CuSO4溶液遇強堿即生成Cu（OH）2沉淀,不利于分析過程中的準確移取。本研究準備Cu2+儲備液時,預先在CuSO4溶液中加入酒石酸鉀鈉。Cu2+與酒石酸鉀鈉反應生成水溶性配合物,再加入NaOH溶液就不會產(chǎn)生Cu（OH）2沉淀,得到的Cu2+儲備液為淺藍色透明溶液。由于Cu2+與BSA中的多個肽鍵在堿性環(huán)境下配位形成更穩(wěn)定的雙縮脲類絡合物[22],將Cu2+溶液與BSA溶液混合溶液顏色迅速變?yōu)樽仙?表明Cu-酒石酸已轉化為水溶性的BSA-Cu配合物。

為了研究BSA-Cu配合物的形成過程,分別測定了CuSO4、Cu-酒石酸和BSA-Cu溶液的吸收光譜。從圖1可知,上述3種溶液的顏色存在明顯差異,它們的最大吸收波長分別位于800、640和540 nm,且吸收峰重疊程度小。因此,通過觀察溶液顏色的變化或測定它們的吸收光譜,可了解BSA-Cu配合物的形成過程。圖1B是BSA濃度與BSA-Cu溶液最大吸收波長下吸光度的關系曲線。當固定溶液中Cu2+儲備液加入量為1 mL時,隨著BSA溶液加入體積增加,BSA-Cu體系在540 nm處的吸光度迅速增大,表明有更多的Cu-酒石酸轉化為BSA-Cu配合物。當BSA體積增大到2 mL時,吸光度達到最大。繼續(xù)增加BSA的濃度,吸光度基本保持不變,說明溶液中Cu-酒石酸已完全轉化為BSA-Cu配合物。BSA-Cu配合物的形成顯著降低了體系中游離Cu2+的濃度,導致Cu2+/Cu0的還原電位降低,有利于加快銅納米簇形成速率。為進一步提高BSA-Cu配合物的穩(wěn)定性,銅納米簇合成中BSA溶液用量選擇為3 mL。

圖1 A：CuSO4（a）、Cu-酒石酸（b）和BSA-Cu（c）溶液的吸收光譜；B：BSA的體積與BSA-Cu溶液最大吸收波長下吸光度關系曲線。Fig.1 A：Absorption spectra of CuSO4（a）,Cu-tartrate（b）and BSA-Cu solution（c）.Inset：Optical photographs of CuSO4（I）,Cu-tartrate（II）,BSA-Cu solution（III）.B：Relationship curve of BSA volume with absorbance atmaximum absorption wavelength of the BSA-Cu solution

3.2 H2O2對銅納米簇形成的催化行為

BSA在銅納米簇的制備過程中發(fā)揮著多種功能。一方面,BSA中的巰基與Cu+結合形成穩(wěn)定的CuS鍵,銅納米簇表面包裹一層致密的BSA親水性殼,從而顯著提升了納米簇的穩(wěn)定性和在水中的溶解度。另一方面,BSA中的游離巰基有一定還原性,可將BSA-Cu中的Cu2+還原為Cu0,形成銅納米簇。由圖2可見,BSA-Cu溶液有一個弱小的熒光發(fā)射峰,表明產(chǎn)生了銅納米簇。然而,熒光強度增加非常緩慢。這是因為BSA還原Cu2+的能力較弱,銅納米簇的形成需要較長時間才能完成。為了加快銅納米簇的生成,在體系中引入少量H2O2作為催化劑,此時體系熒光強度顯著增長。當反應時間超過10min,熒光強度的增勢變緩,隨后增加幅度與未加H2O2時相當。實驗表明,H2O2對銅納米簇的形成具有高效催化作用。隨著H2O2的消耗殆盡,銅納米簇的產(chǎn)生速率也趨于平常。

圖2 BSA-Cu體系在無H2O2（a）和1.0×10-3mol/LH2O2存在下（b）的熒光光譜（A）及420 nm處的熒光強度隨時間的變化曲線（B）。激發(fā)波長、反應溫度和時間分別為320 nm、45℃和10minFig.2 Fluorescence spectra（A）and change curves（B）of BSA-Cu system in the absence of H2O2（a）and the presence of 1.0×10-3mol/L H2O2（b）.The excitation wavelength,reaction temperature and time are 320 nm,45℃ and 10min,respectively

同步熒光和圓二色譜技術被應用于研究H2O2加入前后BSA構型的變化。圖3是BSA和BSA-Cu配合物加入H2O2前后的同步熒光光譜。通常,同步熒光光譜能給予一些發(fā)色團的分子環(huán)境信息,如BSA中的酪氨酸和色氨酸。同步熒光光譜中最大發(fā)射峰的移動反映了發(fā)色團分子極性環(huán)境的變化。當激發(fā)波長與發(fā)射波長的Δλ為15和60 nm時,同步熒光光譜給予的分別是酪氨酸和色氨酸的環(huán)境特征信息[23]。從圖3可見,H2O2加入后BSA和BSA-Cu的酪氨酸和色氨酸熒光強度都有增強,這證明H2O2的加入導致BSA和BSA-Cu結構變化,增加了酪氨酸和色氨酸的暴露程度,導致同步熒光強度有所增加。

圖3 H2O2加入前（b）后（a）BSA的同步熒光光譜,H2O2加入前（d）后（c）BSA-Cu同步熒光光譜Fig.3 SynchronousfluorescencespectraofBSAbefore（b）andafter（a）addedH2O2,synchronous fluorescencespectraofBSA-Cubefore（d）andafter（c）addedH2O2（b）Δλ：15nm（A）and60nm（B）,pH：12,BSA：15mg/mL,H2O2：1.0×10-3mol/L

圓二色譜分析結果可以反映蛋白中二級結構的變化。表1是BSA、BSA-H2O2、BSA-Cu和BSA-Cu-H2O2體系中BSA的二級結構。表1表明,H2O2的加入降低了BSA的α-螺旋結構,增加了β-轉角和無序結構,這說明H2O2破壞了BSA中部分有序結構。相對于BSA的二級結構,BSA-Cu體系中α-螺旋結構比例明顯減少。因為Cu2+破壞了蛋白質(zhì)中氨基酸殘基亞氨基 （NH）上的氫原子和羰基上的氧原子之間形成的氫鍵,繼而與肽鏈形成配合物。表1還顯示,在BSA-Cu溶液中加入H2O2后,α-螺旋結構的比例進一步降低,證明Cu2+催化存在下H2O2對BSA具有更強的破壞作用,基團暴露程度更大,導致α-螺旋等有序結構進一步下降。

表1 不同體系中BSA的二級結構Table1 SecondarystructuresofBSAindifferentsystem

同步熒光和圓二色譜分析結果表明,H2O2在銅納米簇形成過程中發(fā)揮了兩種作用,一方面,在堿性條件下,Cu2+催化H2O2產(chǎn)生·OH自由基。與H2O2相比,·OH自由基有更強的氧化性,它破壞了BSA分子的部分二硫鍵,巰基和氨基更充分暴露[20]。所產(chǎn)生的游離氨基與Cu2+充分結合成穩(wěn)定的配合物,降低Cu2+/Cu0的還原電勢,加快銅納米簇形成。同時,裸露出來的巰基能與Cu+形成穩(wěn)定的CuS進一步提高了銅納米簇的穩(wěn)定性。另一方面,H2O2作為配體可與BSA-Cu結合形成飽和的BSA-Cu-H2O2配合物。由于BSA配位環(huán)境空間位阻大,Cu2+不可能同時與4個氨基形成四配體飽和配合物[21,22]。然而,H2O2分子小,配位能力強,可深入到BSA-Cu內(nèi)部與Cu2+雜化軌道中未成鍵的軌道成鍵,形成更為穩(wěn)定的BSA-Cu2+-H2O2配合物。配合物穩(wěn)定性的提高可減少體系中游離Cu2+濃度,進一步降低了Cu2+/Cu0的還原電勢?？傊?H2O2的加入降低了Cu2+/Cu0的還原電勢,增加了銅納米簇的穩(wěn)定性,從而加快了銅納米簇形成。

3.3 L-半胱氨酸對銅納米簇熒光的猝滅作用

為了研究L-半胱氨酸與銅納米簇之間的相互作用,分別測定了加入L-半胱氨酸前后銅納米簇溶液的熒光光譜。由圖4可見,L-半胱氨酸的加入使銅納米簇的熒光強度明顯下降,實現(xiàn)了對BSA-Cu體系熒光“關”響應,這表明L-半胱氨酸對體系的熒光具有顯著的猝滅效應。

為探究導致熒光猝滅的原因,采用透射電鏡研究了銅納米簇在加入L-半胱氨酸前后的粒子形貌及聚集形式。由圖5可見,以H2O2作為添加劑制備的銅納米簇的形狀為規(guī)整的球形,粒徑均勻,平均粒徑在0.5～1.5nm之間。然而,加入L-半胱氨酸后,銅納米簇發(fā)生明顯的團聚現(xiàn)象,且形狀變得不規(guī)整,說明L-半胱氨酸與銅納米簇相互作用導致了銅納米簇的聚集和破壞。L-半胱氨酸屬于生物巰基類小分子氨基酸,游離巰基中的硫能在銅表面提供電子對,協(xié)調(diào)電子的不飽和狀態(tài),同時這也存在一個空置的軌道,由此更容易吸附在銅表面,對銅具有強的螯合能力[23,24]。盡管BSA穩(wěn)定的銅納米簇表面被一層BSA殼層包裹,但表面仍存在空隙,親水性L-半胱氨酸可穿透BSA殼而深入到銅納米簇表面,并與Cu結合。這種結合將破壞已經(jīng)形成的CuS鍵,使BSA殼層與銅納米簇表面脫離,失去對銅納米簇的保護作用,最終導致銅納米簇團聚。同時,銅納米簇從外殼脫離程度愈大,愈容易被溶解氧氧化腐蝕,造成熒光猝滅[25]。

圖4 加入1.0×10-2mol/L L-半胱氨酸前（a）后（b）銅納米簇的熒光光譜。激發(fā)波長、反應溫度和時間分別為320 nm、25℃和30minFig.4 Fluorescence spectra of copper nanoclustars （CuNCs）before（a）and after（b）the addition of1.0× 10-2mol/L of L-cysteine with an excitation wavelength of 320 nm.The reaction temperature and time are 25℃ and 30min,respectivelty

圖5 加入L-半胱氨酸前（A）后（B）銅納米簇的TEM圖Fig.5 TEM images of copper nanoclusters before（A）and after（B）the addition of L-cysteine

3.4 H2O2對BSA-Cu熒光“開”響應動力學特征

為進一步研究H2O2對BSA-Cu體系熒光“開”響應的動力學特征,考察了H2O2加入量對熒光強度的影響。由圖6可見,H2O2濃度不影響熒光發(fā)射峰形狀,它們的最大發(fā)射波長均在420 nm。然而,體系熒光強度隨 H2O2加入量的增加而迅速增大。當H2O2濃度在1.0×10-6～1.5×10-3mol/L之間,熒光強度（F）與H2O2濃度（C,mmol/L）呈現(xiàn)良好的線性關系,線性方程為F=471.65C+22.087,相關系數(shù)R2為0.9983,方法檢出限達到 3.1×10-7mol/L （S/N=3）?；贐SA-Cu體系對H2O2熒光“開”響應,建立了測定H2O2含量的熒光分析方法。采用此方法測定20份H2O2溶液（0.5mmol/L）,檢測結果標準偏差為2.2％,表明方法具有良好的重現(xiàn)性。將BSA溶液和Cu2+儲備液在4℃儲藏一定時間,然后用于檢測0.5×10-3mol/L H2O2。結果表明,儲備液儲藏3個月后測定結果相對偏差小于1.8％,表明儲備液有較好的穩(wěn)定性。

圖6 A：不同H2O2濃度下BSA-Cu體系的熒光光譜；B：熒光峰強度與H2O2濃度關系曲線。Fig.6 A：Fluorescence spectra of BSA-Cu system in the presence of 0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.25, 0.35,0.50,0.60,0.75,0.85,1.00,1.20,1.30,1.40 and 1.50mmol/L H2O2respectively（from a to p）.B：Relationship curve of fluorescence peak intensity with H2O2concentration

不同外來成分被分別加入到BSA-Cu溶液,然后在熒光光度計上測定體系熒光強度變化（ΔF）,結果見圖7。在所有測試對象中,僅有H2O2能顯著提高體系的熒光強度,再次證明H2O2的存在對銅納米簇的形成具有較大的催化作用；CI-,F-,K+,Ca2+,Al3+,Na+,Mg2+和Zn2+本身還原能力差,它們對Cu2+轉化為Cu0的反應沒有促進作用,因此相當于5倍于H2O2濃度（1.0mmol/L）的上述離子僅產(chǎn)生一個極小的熒光增加；Hg2+和Pb2+的存在將導致體系熒光強度下降。一方面,Hg2+和Pb2+能與BSA中的游離巰基結合形成穩(wěn)定的硫化物,使BSA喪失還原Cu2+的能力,從而抑制了銅納米簇的形成；另一方面,Hg2+和Pb2+可能對已形成的銅納米簇表面CuS鍵作用,造成BSA殼層的脫落,使銅納米簇氧化而分解,從而導致熒光強度下降。研究表明,預先在樣品中加入少量EDTA螯合劑可以消除 Hg2+和 Pb2+對測定的干擾；CH3COOH和CH3CONH2的引入BSA-Cu體系對熒光強度略有增加。這是因為它們都有含孤電子對的原子,通過供電子效應使銅納米簇量子效率提高,從而導致熒光強度略有增加。然而,它們對H2O2測定的影響是容易消除的。研究表明,CH3COOH和CH3CONH2對體系的作用是一個相對慢的動力學過程。CH3COOH 或CH3CONH2加入使體系熒光強度緩慢增長,這一速率明顯低于H2O2對體系熒光強度的影響。因此,實際樣品測定時可以利用樣品加入后一個迅速的熒光增加過程對H2O2進行定量分析,從而有效避免了因CH3COOH或CH3CONH2存在對測定結果的干擾。

圖7 不同干擾物（5mmol/L）對BSA-Cu體系檢測H2O2的影響。ΔF=F-F0,為BSA-Cu體系加入不同成分前（F0）后（F）測得的熒光強度變化值。Fig.7 Fluorescence intensity of different substances （5mmol/L）in the presence of BSA-Cu.ΔF=F-F0, were the fluorescence intensity of BSA-Cu in the absence （F0）and presence（F）of various substances

3.5 L-半胱氨酸對銅納米簇熒光“關”響應的分析性能

在銅納米簇的溶液中分別加入不同濃度的L-半胱氨酸,然后在熒光光度計測定體系的熒光光譜。由圖8A可見,在0.2～10mmol/L之間,銅納米簇熒光強度與L-半胱氨酸濃度線性相關,回歸方程為F=-6946.4C（mmol/L）+768.33,相關系數(shù)為R2=0.9997,檢出限為5.7×10-5mol/L（S/N=3）?；贐SA-Cu體系對L-半胱氨酸熒光“關”響應,建立測定L-半胱氨酸含量的熒光分析方法。采用此方法測定20份1.0mmol/L L-半胱氨酸,檢測結果標準偏差為1.8％,表明本方法具有良好的重現(xiàn)性。將銅納米簇溶液在4℃條件下儲藏一定時間,然后用于檢測1.0mmol/L L-半胱氨酸。結果表明,銅納米簇儲藏3個月后測定結果相對偏差小于2.4％,表明以BSA為保護劑的銅納米簇具有良好的穩(wěn)定性。

圖8 A：不同濃度的L-半胱氨酸存在下銅納米簇的熒光光譜；B：熒光強度與L-半胱氨酸濃度關系曲線。Fig.8 A：Fluorescence spectra of copper nanoclusters in the presence of 0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,3.0, 4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0 and 10.0mmol/L of L-cysteine,respectivelty（from a tom）.B：Relationship curves of fluorescence intensity with L-cysteine concentration

氨基酸的檢測常受到其它氨基酸干擾,本研究考察了12種氨基酸與銅納米簇的作用。由圖9可見,12種氨基酸中,只有L-半胱氨酸（Cys）能顯著猝滅熒光,加入其它氨基酸基本不影響銅納米簇的熒光強度。這應歸因于它們分子結構上的不同。只有L-半胱氨酸中含有游離巰基,它可與銅納米簇表面的銅原子強烈作用,造成銅納米簇的聚集和破壞,導致熒光強度的顯著降低。其它氨基酸中沒有游離巰基,只有少量游離氨基和羧基。由于氨基和羧基與銅的結合力較弱,不能破壞BSA穩(wěn)定的銅納米簇。銅納米簇對L-半胱氨酸特異性地產(chǎn)生熒光“關”響應,表明本分析方法具有較高的選擇性。

圖9 不同氨基酸（0.01 mol/L）對銅納米簇熒光強度的影響。ΔF=F0-F,為銅納米簇溶液加入不同氨基酸前（F0）后（F）測得的熒光強度變化值Fig.9 Effect of different amino acid（0.01 mol/L）on fluorescence intensity of copper nanoclusters.ΔF=F0-F, were the fluorescence intensity of the copper nanoclusters in the absence（F0）and presence（F）of the various amino acids

圖10 銅的重復利用和檢測的循環(huán)方案Fig.10 Schematic of circle detection

3.6 銅的重復利用和分析檢測的循環(huán)

銅是保貴資源又是環(huán)境污染物,它的重復利用具有經(jīng)濟和環(huán)保價值?；贐SA-Cu體系對H2O2和L-半胱氨酸熒光“開-關”響應的特點,設計了銅的重復利用和分析檢測的循環(huán)方案（圖10）。首先,利用H2O2對銅納米簇形成的催化作用實現(xiàn)對微量H2O2的熒光檢測。收集檢測完H2O2后的銅溶液,放置一段時間,其熒光增至最大,完成了Cu2+→Cu0的轉化和銅納米簇的合成；利用L-半胱氨酸對銅納米簇熒光猝滅效應實現(xiàn)對微量L-半胱氨酸的熒光檢測。收集檢測完 L-半胱氨酸后的銅溶液,采用灰化和稀H2SO4溶解相結合的方法將所有Cu0轉化為Cu2+。所得到的CuSO4溶液應用于下一個循環(huán),如此操作可實現(xiàn)銅的重復利用和分析檢測的循環(huán)。

為了檢驗此循環(huán)方法的可行性,分別考察了不同循環(huán)次數(shù)中檢測H2O2和L-半胱氨酸分析方法的線性范圍和檢出限。從表2可知,每次循環(huán)相關的分析參數(shù)基本相近,這說明循環(huán)不影響檢測方法的主要性能指標。另外,每次循環(huán)銅的重復利用率也被測定和計算。結果表明,每次循環(huán)過程中銅的重復利用率在95％以上,表明方案可實現(xiàn)較好的銅重復利用。

3.7 樣品分析

所建立的熒光分析方法應用于藥物中H2O2和L-半胱氨酸的連續(xù)測定。從表3可知,本方法測定結果與相應的參考方法結果一致,其相對標準偏差（RSD）都在0～4％之間,表明本方法具有較好的精密度和準確性。

表2 不同循環(huán)次數(shù)下分析方法的主要技術參數(shù)Table 2 Results of circle detection by proposed method

表3 藥物中H2O2溶液和L-半胱氨酸測定結果Table 3 Detection results of H2O2and L-cysteine in drug formulations

4 結論

在堿性介質(zhì)和Cu2+存在下,H2O2具有強的氧化和螯合能力,促進了Cu2+→Cu0轉化,導致銅納米簇的快速形成和熒光強度的顯著增加?；贐SA-Cu體系對H2O2熒光“開”響應,成功建立了微量H2O2的熒光測定方法。由于L-半胱氨酸中游離巰基可破壞銅納米簇表面的CuS鍵,導致銅納米簇的分解和熒光強度的下降?；贐SA-Cu體系對L-半胱氨酸熒光“關”響應,建立了微量L-半胱氨酸的熒光測定方法。此外,通過Cu2+與Cu0之間相互轉化實現(xiàn)銅的重復利用和分析檢測的循環(huán),方法具有靈敏,低成本和環(huán)保的顯著優(yōu)勢,可廣泛應用于H2O2和L-半胱氨酸的日常分析。此外,研究還可應用于銅納米簇的快速制備。

1 Lin Y H,Ren JS,Qu X G.Acc.Chem.Res.,2014,47（4）：1097-1105

2 Díez I,Ras R H A.Springer Ser.Fluoresc.,2010,9：307-332

3 Li SY,Wei S,Gao ZQ.Chem.Soc.Rev.,2015,44（1）：362-381

4 Yu J,Zhang X J,Hao X J,Zhang X H,Zhou M J,Lee C S,Chen X F.Biomaterials,2014,35（10）：3356-3364

5 Shang L,Dong S J,Nienhaus G U.Nano Today,2011,6（4）：401-418

6 Wu X F,Li R Y,Li Z J,Liu JK,Wang G L,Gu Z G.RSC Adv.,2014,4（48）：24978-24985

7 Li JJ,Wang W J,Sun D F,Chen J N,Zhang P H,Zhang J R,Min Q H,Zhu J J.Chem.Sci.,2013,4（9）：3514-3521

8 Ling Y,Zhang N,Qu F.Spectrochim.Acta,Part A,2014,118：315-320

9 Zhao X J,Huang C Z.New J.Chem.,2014,38（8）：3673-3677

10 Yang X M,Feng Y J,Zhu SS,Luo YW,Zhuo Y,Dou Y.Anal.Chim.Acta,2014,847：49-54

11 Jia X F,Yang X,Li J,Li D Y,Wang E K.Chem.Commun.,2014,50（2）：237-239

12 Jia X F,Li J,Wang E K.Small,2013,9（22）：3873-3879

13 LiW H,LiW,Hu Y F,Xia Y L,Shen Q P,Nie Z,Huang Y,Yao SZ.Biosens.Bioelectron.,2013,47：345-349

14 Jia X F,Li J,Han L,Ren JT,Yang X,Wang E K.ACSNano,2012,6（4）：3311-3317

15 Hu L Z,Yuan Y L,Zhang L,Zhao JM,SaadatM,Xu G B.Anal.Chim.Acta,2013,762：83-86

16 Wu X F,Li R Y,Li Z J.RSC Adv.,2014,4（20）：9935-9941

17 Rama G,Amaresh K S,Siddhartha S G,Anumita P,Arun C.ACS Applied Materials＆Interfaces,2014,6（6）：3822-3828

18 WangW,Leng F,Zhan L,Chang Y,Yang X X,Lan J,Huang C Z.Analyst,2014,139（12）：2990-2993

19 Zhao T,He XW,LiW Y,Zhang Y K.J.Mater.Chem.B,2015,3（11）：2388-2394

20 Xu S J,Chen F N,Deng M,Sui Y Y.RSC Adv.,2014,4（30）：15664-15670

21 Wang C,Wang C X,Xu L,Cheng H,Lin Q,Zhang C.Nanoscale,2014,6（3）：1775-1781

22 Drochioiu G,Damocb N E,PrzybylskiM.Talanta,2006,69（3）：556-564

23 Zhang H,Liu R T,Chi Z X,Gao C Z.Spectrochim.Acta,Part A,2011,78：523-527

24 Zou M M,Li Y,Wang J,Gao JQ,Wang Q,Wang B X,Fan P.Spectrochim.Acta,Part A,2013,112：206-213

25 SUN Tao,GUO Hong-Rui,XU Huan-Lin,ZHOU Bao-Kuan.Chem.J.Chinese Universities,2007,28（5）：856-858

孫濤,郭洪瑞,許環(huán)麟,周寶寬.高等學?；瘜W學報,2007,28（5）：856-858

26 Li Z P,Li K A,Tong SY.Anal.Lett.,1999,32（5）：901-913

27 Wu Z Z,LiW Y,Chen J,Yu C.Talanta,2014,119：538-543

28 Chen Z,Lu D T,Cai ZW,Dong C,Shuang SM.Luminescence,2014,29（7）：722-727

29 Hu Y H,Wu Y M,Chen T T,Chu X,Yu R Q.Anal.Methods,2013,5（14）：3577-3581

（Received 20 May 2015；accepted 3 July 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21176101）

Fluorescence"on-off"Response of Bovine Serum Album in-Cu System Towards Hydrogen Peroxide and L-Cysteine and Their Analysis Applications

LIAO Xiao-Qing1,WANG Hui-Ying1,LIZai-Jun*1,21（School ofChemical and Materials Engineering,Jiangnan University,Wuxi214122,China）
2（The Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology,Ministry ofEducation,Jiangnan University,Wuxi214122,China）

The synthesis and application of copper nanoclusters（CuNCs）as optical probe have attracted a great attention.The study shows that bovine serum albumin（BSA）CAN reactwith copper ions（Cu2+）in a basemedium to form stable BSA-Cu complex.In the solution,the introduction of hydrogen peroxide can remarkably accelerate the formation of CuNCs.At the same time,the fluorescence intensity rapidly increases.Based on the fluorescence"light-on"response of BSA-Cu system,a kineticsmethod was developed for the fluorescent detection of hydrogen peroxide.The fluorescence intensity of BSA-Cu linearly increased with the increase of hydrogen peroxide in the range from 1.0×10-6mol/L to 1.5×10-3mol/L with the detection limit of 3.1×10-7mol/L（S/N=3）.After that,the collected BSA-Cu solution was placed until its fluorescence intensity increases to the maximum value,in which the Cu2+ions were fully changed into CuNCs.The experiment demonstrated that the addition of L-cysteine into the solution led to an obvious fluorescence quenching.Based on the fluorescence"light-off"response of BSA-Cu system towards L-cysteine,an analytical method was established for the fluorescent determination of L-cysteine.The fluorescence intensity linearly reduced with the increase of L-cysteine concentration in the range of 2.0×10-4-1.0×10-2mol/L with the detection limit of 5.7×10-5mol/L（S/N=3）.Finally,the resulted BSA-Cu waste was treated by high temperature ashing and then dissolvingwith sulfuric acid,in which the CuNCswere turned into Cu2+ions.The resulting Cu2+solution continued to be used for the detection of H2O2and L-cysteine in the next cycle.In the work,the cycle detection of hydrogen peroxide and L-cysteine and reuse of copper could be achieved using the conversion between Cu2+and copper nanoclusters.Themethod provides the characteristics of high sensitivity, low cost and environment-friendly,and can be widely used for routine analysis of hydrogen peroxide and L-cysteine.

Copper ions；Copper nanoclusters；Fluorescence probe；Hydrogen peroxide；L-Cysteine

10.11895/j.issn.0253-3820.150413

2015-05-20收稿；2015-07-03接受

本文系國家自然科學基金資助項目（No.21176101）

E-mail：zaijunli@jiangnan.edu.cn