新型萘酰亞胺類衍生物8c誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP凋亡作用研究

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所，上海200062

新型萘酰亞胺類衍生物8c誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP凋亡作用研究

王子元，殷佩浩，許建華，季青，倪振華，孫健，馬艷春

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所，上海200062

背景與目的：細(xì)胞凋亡受阻是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要因素，從細(xì)胞凋亡的研究入手，將為腫瘤的治療和耐藥性的逆轉(zhuǎn)開辟新的途徑。本研究觀察一種新型萘酰亞胺類衍生物8c對(duì)結(jié)腸癌HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞的作用，探討誘導(dǎo)HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)8c對(duì)HCT116/ L-OHP細(xì)胞的增殖抑制作用；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察8c對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡的影響；采用實(shí)時(shí)定量PCR(realtime PCR)檢測(cè)p53 mRNA、Bax mRNA及Bcl-2 mRNA水平變化；蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)p-p53、Bax、Bcl-2及細(xì)胞色素c(Cyt-c)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：8c抑制HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50=8.16 μmol/L)低于陽(yáng)性對(duì)照氨奈菲特(IC50=28.37 μmol/L)；藥物作用后，8c誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，凋亡通路中p53(Ser15)磷酸化水平上升，但p53 mRNA水平不受影響；Bax蛋白水平及mRNA水平明顯上升，Bcl-2蛋白及mRNA水平下降，使得Bax/Bcl-2比例增加，同時(shí)8c又引起細(xì)胞色素c的釋放。結(jié)論：8c通過(guò)磷酸化p53 Ser-15位點(diǎn)激活p53，隨即激活細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，這可能是8c抑制結(jié)腸癌HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。8c具有良好的抗腫瘤及抗耐藥潛力和開發(fā)應(yīng)用前景。

萘酰亞胺類衍生物；結(jié)腸癌；凋亡

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌［1］。以?shī)W沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)、長(zhǎng)春新堿(vincristine，VCR)等為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助化療已成為結(jié)腸癌患者的一線治療方案。然而，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及對(duì)化療藥物的耐藥性，使化療的臨床效果受到不同程度的限制［2-4］。近幾年，細(xì)胞凋亡與多藥耐藥及腫瘤細(xì)胞的抗藥性的關(guān)系日益受到關(guān)注。有研究［5］發(fā)現(xiàn)，抑制凋亡與耐藥的形成存在一定的關(guān)系。目前很多化合物或藥物具有抗腫瘤作用，但都存在較強(qiáng)的不良反應(yīng)和易引發(fā)耐受等不足。因此，篩選一種高效低毒的抗腫瘤藥物就成了抗癌新藥的研發(fā)首選，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

本研究前期合成了一系列萘酰亞胺類衍生物，發(fā)現(xiàn)其中一種化合物6-｛2-［2-(二甲胺基)乙基胺基］乙基｝-2-辛基-1H-苯并［de］異喹啉-1,3(2H)-二酮(8c)能明顯抑制結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)。8c是在萘酰亞胺類topoⅡ抑制劑——氨奈菲特(amonafide)的基礎(chǔ)上，通過(guò)在6位引入多氨鏈，2位引入長(zhǎng)烷鏈(圖1)，從而有效緩解氨奈菲特的毒性，具有一定開發(fā)潛力［6］。

本研究在此基礎(chǔ)上，研究8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP的增殖影響作用，探討8c誘導(dǎo)HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡作用的分子機(jī)制。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于萘酰亞胺類化合物的抗腫瘤的分子機(jī)制凋亡研究報(bào)道較少，因此，本研究對(duì)于開發(fā)新的抗腫瘤藥物有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景。

圖1 氨奈菲特與8c化合物結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of amonafide and 8c

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

化合物8c由華東理工大學(xué)錢旭紅教授課題組合成并提供，純度>99.5%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；HCT116/L-OHP耐奧沙利鉑HCT116耐藥細(xì)胞由本院實(shí)驗(yàn)中心誘導(dǎo)，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中(含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素)，并置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了獲得耐藥株HCT116/L-OHP的多藥耐藥表型，L-OHP (終濃度為5 μg/mL)始終加在HCT116/L-OHP細(xì)胞的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)前1周停止加藥。小牛血清、培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。p-p53、Bax、Bcl-2和Cyt-c抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。CCK-8試劑盒、Hoechst33258和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒購(gòu)自上海美季生物醫(yī)藥科技有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育24 h后，加入不同濃度的化合物，以不含化合物的培養(yǎng)細(xì)胞為空白對(duì)照組，以含DMSO的培養(yǎng)細(xì)胞為陰性對(duì)照，以含氨奈菲特的培養(yǎng)細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞和不做任何處理的培養(yǎng)基3個(gè)孔消除背景干擾。共同溫育48 h后，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入CCK-8(10 μL/孔)，使每孔總體積為100 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(D)值，檢測(cè)波長(zhǎng)450～490 nm，參比波長(zhǎng)600～650 nm，分析數(shù)據(jù)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，然后繪制成圖表，細(xì)胞存活率為50%的值為半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞存活率(%)=(D試驗(yàn)組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100%。

1.2.2 LDH法(乳酸脫氫酶法)檢測(cè)細(xì)胞活力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于24孔板中，每孔細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入不同濃度的化合物，同時(shí)以氨奈菲特為陽(yáng)性對(duì)照藥，培養(yǎng)48 h后，上清液按照LDH試劑盒說(shuō)明操作；沉淀細(xì)胞分別加1 mL終濃度為0.2%的TritonX-100裂解液37 ℃避光振蕩15 min后按照LDH試劑盒說(shuō)明操作［7］。

1.2.3 Hoechst染色檢測(cè)藥物對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(2×105個(gè)/mL)接種于24孔板，加入不同濃度8c，以氨奈菲特為陽(yáng)性對(duì)照藥，空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液。處理48 h后離心，棄上清液，用PBS洗2次，離心去上清液(370×g，5 min)。加固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)，4 ℃固定10 min。采用Hoechst33258(5 μL/mL)染色5 min。356 nm紫外激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Promega)進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑商提供指南進(jìn)行操作，簡(jiǎn)述如下：以氨奈菲特為陽(yáng)性對(duì)照藥，8c作用細(xì)胞48 h后，重懸于Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液(1×)中，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，室溫避光溫育10 min，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液(1×)輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴中避光放置10 min；用FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品，Cell Quest軟件(Becton)及Modifit軟件并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)

利用Total RNA Isolation試劑盒(Qiagen)提取總RNA，測(cè)定濃度并檢測(cè)RNA完整性，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。利用Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司］將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒提供信息配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。利用SYBR PrimeScript real-time PCR反應(yīng)試劑盒［購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司］進(jìn)行realtime PCR反應(yīng)，按照試劑盒提供信息配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：95 ℃變性5 min，95 ℃15 s，55 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s。以GAPDH作為內(nèi)參，使用引物序列見表1。

表1 引物序列Tab. 1 Sequences of primers

1.2.6 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)

藥物作用后，細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，冷PBS液沖洗2遍，采用細(xì)胞刮片收集細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，15 294×g離心10 min，收集上清液，進(jìn)行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ坑镜酪?0 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。室溫封閉3 h，加一抗，室溫下溫育2 h。再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫下溫育1 h，采用NBT/BCIP系統(tǒng)顯色，記錄結(jié)果并進(jìn)行D值掃描分析，除以β-actin D值所得的比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP的生長(zhǎng)抑制作用

CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8c組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，隨著濃度的增加，細(xì)胞的增殖數(shù)目下降，各濃度組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Origin軟件作圖分析計(jì)算，48 h的IC50為8.16 μmol/L，陽(yáng)性對(duì)照藥物氨奈菲特對(duì)該細(xì)胞的IC50為28.37 μmol/L，8c的IC50較陽(yáng)性對(duì)照藥物明顯偏小，且隨劑量增大，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性(圖2)。

圖2 8c和氨奈菲特對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 The effect of 8c and amonafide on the viability of HCT116/L-OHP cells.

2.2 8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP LDH漏出率的影響

HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞經(jīng)不同濃度8c作用48 h后，LDH漏出率有不同程度的增加，并呈劑量依賴性。各組細(xì)胞LDH漏出率值見表2。

2.3 8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP的形態(tài)學(xué)影響

結(jié)果如圖3顯示，空白對(duì)照組無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化，所發(fā)熒光較均勻。與空白對(duì)照組相比，隨著8c濃度的提高，凋亡特征越發(fā)明顯，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，呈現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、核碎裂以及出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡特征；提示8c能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，與陽(yáng)性對(duì)照藥氨奈菲特相比，凋亡效果明顯，可能是其抗腫瘤及抗耐藥作用的重要分子機(jī)制。

表2 8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP LDH漏出率的影響Tab. 2 Effect of 8c on LDH leakage rate of HCT116/L-OHP cells

2.4 8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP凋亡的影響

凋亡結(jié)果顯示，藥物作用48 h后，8c誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A，P<0.05)?？偟蛲雎孰S8c濃度升高而升高，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性且明顯高于對(duì)照組。與8 μmol/L 8c作用HCT116/L-OHP細(xì)胞相比，8 μmol/L氨奈菲特作用該細(xì)胞后凋亡比率變化不大，25 μmol/L氨奈菲特作用后的總凋亡率與8 μmol/L 8c作用后的凋亡率基本一致(圖4B)，由此表明HCT116/L-OHP細(xì)胞對(duì)8c作用比氨奈菲特敏感。

2.5 8c對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP中凋亡相關(guān)通路的影響

8c作用后，凋亡通路中p53(Ser-15)磷酸化水平和Bax蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，且8c誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放(圖5A)。陽(yáng)性對(duì)照組氨奈菲特不影響p53(Ser-15)磷酸化水平，但Bax、Bcl-2及細(xì)胞色素C的表達(dá)趨勢(shì)與8c一致。同時(shí)，real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，8c作用后，耐藥細(xì)胞中Baχ的轉(zhuǎn)錄水平上升，Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平下降，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5B)。該結(jié)果與WB蛋白表達(dá)水平的結(jié)果相一致，然而，8c作用HCT116/L-OHP細(xì)胞后，沒有影響p53 mRNA水平，陽(yáng)性對(duì)照組氨奈菲特具有與8c相同的表達(dá)趨勢(shì)。提示8c抗腫瘤活性可通過(guò)磷酸化Ser-15位點(diǎn)活化抑癌因子p53，同時(shí)Bax/Bcl-2比例的增加、細(xì)胞色素c的釋放在8c誘導(dǎo)的HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。

圖3 Hoechst 33258熒光核染色法對(duì)8c和氨奈菲特作用的HCT116/L-OHP細(xì)胞進(jìn)行核染色Fig. 3 Fluorescent staining of nuclei in 8c and amonafide-treated HCT116/L-OHP cells by Hoechst 33258

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析8c及amonafide誘導(dǎo)的HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡作用Fig. 4 Flow cytometry analysis of 8c and amonafide induced apoptosis in HCT116/L-OHP cells using Annexin Ⅴ-FITC/PI

3 討 論

結(jié)腸癌是人類高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率在全球癌癥中位居第3位，其死亡率居惡性腫瘤死因的第2位，而且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［8］。以L-OHP、長(zhǎng)春新堿等為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助化療已成為結(jié)腸癌患者的一線治療，但化療藥物在抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，其較強(qiáng)的不良反應(yīng)和易引發(fā)耐受等不足限制了其藥理機(jī)制的研究及進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。因此，提高治療的療效和選擇性，克服耐藥是今后開發(fā)抗癌藥物的主要目標(biāo)。近幾年，在治療癌癥的研究領(lǐng)域中，因萘酰亞胺類衍生物具有良好的抗腫瘤作用，已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［9-10］。

本研究在此背景下，通過(guò)對(duì)氨奈菲特母體進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)、合成一系列萘酰亞胺類衍生物，從中篩選出化合物8c，低濃度即可抑制結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖，半數(shù)抑制濃度為8.16 μmol/L，并圍繞該化合物的抗癌效果，進(jìn)行其藥物作用機(jī)制的研究。通過(guò)Hoechst染色及Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。與對(duì)照組相比，4 μmol/L濃度可引起耐藥細(xì)胞總凋亡率為56.35%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是近年眾多化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的共同目的［11］，因此，凋亡受抑可能是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一［12-13］。明確有利于藥物誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制以及腫瘤是怎樣逃避凋亡，可以解釋癌癥發(fā)生和治療之間的聯(lián)系，并且能夠得到更合理的方法來(lái)設(shè)計(jì)抗癌藥物和治療癌癥。分子機(jī)制研究顯示，與陽(yáng)性對(duì)照藥氨奈菲特相比，8c能上調(diào)p53(Ser-15)磷酸化水平，但p53 mRNA水平無(wú)明顯變化。而陽(yáng)性藥氨奈菲特對(duì)p53磷酸化水平?jīng)]有影響，因此，8c可能是通過(guò)磷酸化p53 Ser-15位點(diǎn)激活p53，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，8c劑量依賴性地上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，使得Bax/Bcl-2比例增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，提示8c能激活凋亡通路。

圖5 8c及氨奈菲特對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of 8c and amonafide on the protein and mRNA expressions of apoptotic-related proteins

本研究發(fā)現(xiàn)新型萘酰亞胺類衍生物8c抗腫瘤作用具有抑制結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞多藥耐藥的能力，主要表現(xiàn)為8c誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制主要通過(guò)激活抑癌因子p53激活凋亡通路，從而抑制結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP的增殖。目前，萘酰亞胺類化合物抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的藥效藥理學(xué)研究報(bào)道較少，本研究通過(guò)將一般抗腫瘤藥物的研究方法用于衍生物8c，為其開發(fā)抗癌新藥作理論積累和技術(shù)支持。此外，本研究闡明8c抗腫瘤的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)8c抗腫瘤的作用靶點(diǎn)，為開發(fā)其他抗癌新藥奠定理論基礎(chǔ)。以該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，開發(fā)以新型萘酰亞胺類新藥治療耐藥結(jié)腸癌，具有不可估量的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，可進(jìn)一步設(shè)計(jì)相關(guān)臨床課題，開展雙盲、隨機(jī)、對(duì)照研究及臨床應(yīng)用，以期更好的將基礎(chǔ)研究結(jié)論轉(zhuǎn)化為醫(yī)學(xué)實(shí)踐手段。

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Research on the molecular mechanism of a novel naphthalimide derivative 8c inducing apoptosis in multidrug resistant colon cancer cells

WANG Ziyuan, YIN Peihao, XU Jianhua, JI Qing, NI Zhenhua, SUN Jian, MA Yanchun (Central Laboratory, Putuo Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Interventional Cancer Institute of Chinese Integrative Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China)

WANG Ziyuan E-mail: cjwzymerck@sina.com

Background and purpose:Suppression of apoptotic signaling pathways is an important factor in tumor cell resistance. Research on cell apoptosis will open up a new way of reversing drug resistance and tumor treatment. This study examined the effects of a novel naphthalimide derivative 8c on multidrug resistant colon cancer HCT116/L-OHP cells and explored the molecular mechanisms underlying the apoptosis induction.Methods:The anti-proliferative effects of 8c were detected by CCK-8 assays and the effects on apoptosis induction were examined by flow cytometry. The mRNA expression levels of p53, Bax and Bcl-2 were measured by real-time PCR; The protein expressions of p-p53, Bax, Bcl-2 and Cyt-c were detected by Western blot.Results:8c (IC50=8.16 μmol/L) seemed to be more potent than amonafide (IC50=28.37 μmol/L) against HCT116/L-OHP cells. 8c induced apoptosis on HCT116/ L-OHP cell lines through intrinsic or mitochondria dependent pathway. The protein expression of phosphorylation of p53 at Ser-15 was increased, but the mRNA level of p53 did not increase in HCT116/L-OHP cells. Bax protein and mRNA levels were significantly increased, and Bcl-2 protein and mRNA levels were decreased, suggesting an increase of Bax/Bcl-2 ratios. Meanwhile, 8c induced a substantial release of cytochrome c from the mitochondria into the cytosol in HCT116/L-OHP cells.Conclusion:8c induced cell death signal by inducing the activation p53 phosphorylation which subsequently activated related protein expressions of apoptotic pathway, which may be an important mechanism of 8c on inhibiting proliferation of HCT116/L-OHP resistant cells. All the results suggested that 8c was a potent compound to be developed as an anti-tumor and anti-resistance agent for clinic application in the future.

Naphthalimide derivative; Colon cancer; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.005

R735.3+5

A

1007-3639(2015)05-0345-07

2014-04-28

2014-11-30）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81303102)。

王子元 E-mail:cjwzymerck@sina.com