微波協(xié)同酶法提取刺玫葉總黃酮工藝研究

王曉林，鐘方麗，薛健飛，單雪娜

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林132022）

山刺玫（Rosa davurica）系薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布于東北、山西、內(nèi)蒙古等地。其果實(shí)富含皂苷、黃酮、多糖等活性成分［1-3］，具有降血糖、降血壓、除血栓、抗衰老及保肝等眾多藥理作用［4-6］，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的食、藥同源的寶貴資源。有關(guān)山刺玫果已有詳細(xì)研究［7-10］，目前關(guān)于刺玫葉研究的很少，而刺玫葉與果相比資源更豐富，價(jià)廉易得，本課題組采用HPLC法和UV法對(duì)刺玫葉中金絲桃苷和總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定［11］，為了進(jìn)一步提高刺玫葉的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)微波協(xié)同酶法提取刺玫葉總黃酮的工藝進(jìn)行了初步探索，酶法提取是近年來(lái)應(yīng)用較廣泛的一種植物有效成分提取新技術(shù)，具有高效、無(wú)毒、條件溫和、易于控制、能保持生物活性等優(yōu)點(diǎn)［12-13］，如酶法輔助提取沙棘果渣、枸杞、銀杏葉總黃酮等［14-16］。本研究將為刺玫葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 刺玫葉采自吉林市豐滿區(qū)小白山，經(jīng)吉林化工學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫（Rosa davurica），秋季采收，除去雜質(zhì)，晾干，置干燥處保存；蘆丁，中國(guó)食品藥品檢定研究院（供含量測(cè)定用）；木瓜蛋白酶，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；纖維素酶，湖南紅鷹祥生物股份有限公司；果膠酶，上海金穗生物科技有限公司；三氯化鋁、醋酸、醋酸鈉、無(wú)水乙醇均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為化學(xué)純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 微波輻射萃取儀，MAS-Ⅱ型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品23.2mg于100mL容量瓶中，60%乙醇溶解并定容。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL于25mL容量瓶中，加60%乙醇至6mL，再加入5mL 0.1moL·L-1的三氯化鋁溶液及2.5mL 0.2moL·L-1pH值為5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，60%乙醇溶液定容，搖勻，置于40℃水浴中加熱15min，冷卻至室溫，以顯色劑為空白對(duì)照，在405nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行直線回歸，回歸方程：A=27.147C-0.022 6，R=0.999 6。結(jié)果表明在4.64～32.48μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2 樣品含量測(cè)定 精密吸取刺玫葉提取液適量于25mL容量瓶中，按“1.2.1”項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定，以相應(yīng)刺玫葉提取液為空白，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，計(jì)算出總黃酮提取率，計(jì)算公式如下：

刺玫葉總黃酮提取率（mg·g-1）=總黃酮的質(zhì)量／刺玫葉的質(zhì)量

1.2.3 酶法提取刺玫葉總黃酮的試驗(yàn) 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入到提取燒瓶中，加入25倍量的75%乙醇，加入適宜的酶，在合適的溫度、pH值等條件下酶解，過(guò)濾，合并提取液，按1.2.2節(jié)方法測(cè)定刺玫葉提取液中總黃酮含量，以總黃酮提取率為指標(biāo)，分別考察酶種類及其用量、提取時(shí)間、提取液pH值、提取溫度、提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)［17-20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法提取刺玫葉總黃酮的單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶種類及其用量對(duì)總黃酮得率的影響

2.1.1.1 纖維素酶 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5 g，酶解溫度控制在45℃，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，pH 5.0條件下，選擇不同用量的纖維素酶（20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120 min，90℃、30s滅酶，過(guò)濾，記錄提取液體積，吸取提取液適量于25mL容量瓶中，按1.2.2節(jié)方法測(cè)定提取液總黃酮含量，計(jì)算總黃酮提取率，確定最佳纖維素酶用量。

2.1.1.2 果膠酶 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的果膠酶（20、30、40、50、60、70、80 mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1節(jié)。

2.1.1.3 復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1） 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1、20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1。

2.1.1.4 復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶2） 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶2、20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1。

2.1.1.5 復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=2∶1） 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=2∶1、20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1（圖1）。

圖1 酶種類及用量的影響Fig.1 The influence of varieties and amount of the enzyme

由圖1得知，隨著纖維素酶用量的增加，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)纖維素酶用量為60mg·g-1時(shí)，刺玫葉總黃酮提取率達(dá)到19.48mg·g-1，繼續(xù)增加纖維素酶用量提取率提高幅度較小，因此，纖維素酶用量確定為60mg·g-1。果膠酶用量對(duì)刺玫葉總黃酮提取率影響趨勢(shì)與纖維素酶相似，但提取率低于纖維素酶。當(dāng)復(fù)合酶（纖∶果=1∶1）用量由20mg·g-1增加到60mg·g-1時(shí)，刺玫葉總黃酮提取率隨之提高，當(dāng)復(fù)合酶用量＞60 mg·g-1時(shí)，提取率略有下降。隨復(fù)合酶（纖∶果=1∶2）用量的增加，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，對(duì)刺玫葉總黃酮提取率影響趨勢(shì)與纖維素酶相似，但提取率低于纖維素酶。當(dāng)復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量由20mg·g-1增加到60mg·g-1時(shí)，總黃酮提取率逐步提高，達(dá)到22.02mg·g-1，繼續(xù)增加復(fù)合酶用量提取率提高幅度較小。根據(jù)對(duì)酶種類及用量的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，使用復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）輔助提取刺玫葉總黃酮其提取率高于其他酶，所以選擇復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）輔助提取刺玫葉總黃酮，其最佳用量為70mg·g-1。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，酶解溫度控制在45℃，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH 5.0條件下，分別酶解提?。?.5、1.0、1.5、2.0、2.5h），其他操作同2.1.1.1節(jié)（圖2）。

圖2 提取時(shí)間的影響Fig.2 The influence of extraction time

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，在酶解時(shí)間達(dá)到2.0h時(shí)提取率達(dá)到最高值，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取率反而下降，因此選擇最佳酶解時(shí)間為2.0h。

2.1.3 pH對(duì)總黃酮得率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，酶解溫度控制在45℃，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，分別于pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）條件下酶解提取2.0 h，其他操作同2.1.1.1節(jié)（圖3）。

由圖3可知，隨著pH值的升高，刺玫葉總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)pH=4.5時(shí)提取率達(dá)到最高值，pH值再提高時(shí)，提取率開(kāi)始逐漸下降，因此確定酶解的最佳pH值為4.5。

2.1.4 溫度對(duì)總黃酮得率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH4.5條件下分別在30、35、40、45、50、55、60℃酶解提取2.0h，其他操作同2.1.1.1節(jié)（圖4）。

圖3 pH值的影響Fig.3 The influence of pH

圖4 提取溫度的影響Fig.4 The influence of extraction temperature

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，提取率上升到最高值，溫度再提高，提取率開(kāi)始下降，說(shuō)明此條件下55℃是最佳酶解溫度。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH4.5條件下在55℃酶解提取2.0h，然后將提取殘?jiān)瓷鲜鰲l件（不加酶）分別進(jìn)行第2、3、4、5次提取，其他操作同2.1.1.1節(jié)（圖5）。

圖5 提取次數(shù)的影響Fig.5 The influence of extraction times

2.2 酶法提取刺玫葉總黃酮的正交試驗(yàn)

2.2.1 因素及水平的考察 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以刺玫葉總黃酮提取率為考察指標(biāo)，選擇復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量、提取時(shí)間、pH值和提取溫度作為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化刺玫葉總黃酮的酶解提取工藝。按四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）（表1），在此條件下對(duì)刺玫葉總黃酮進(jìn)行酶解提取，按1.2.2節(jié)方法測(cè)定提取液的吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。

表1 正交試驗(yàn)Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入到提取燒瓶中，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，每組試驗(yàn)的提取溶劑均為75%乙醇，料液比為1∶25，提取2次（表2）。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental data of orthogonal tests

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）輔助提取刺玫葉總黃酮各因素的影響大小為：復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量＞酶解時(shí)間＞pH值＞酶解溫度，刺玫葉總黃酮的最佳酶解提取工藝條件為A2B2C2D2，即料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH值為4.5，提取溫度為55℃，酶解提取時(shí)間為120min，提取次數(shù)2次。

2.3 酶法提取刺玫葉總黃酮工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)

取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入到提取燒瓶中，加入25倍生藥量的75%乙醇和0.175g復(fù)合酶（纖∶果=2∶1），酶解溫度控制在55℃，控制提取液于pH值4.5條件下酶解提取2次，每次120min，其他操作同2.1.1.1。按上述工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果刺玫葉總黃酮提取率分別為29.67、30.32、30.41 mg·g-1，平均為30.13mg·g-1，結(jié)果表明優(yōu)選的刺玫葉總黃酮酶解提取工藝比較穩(wěn)定。

2.4 微波協(xié)同酶法提取刺玫葉總黃酮試驗(yàn)

取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入提取燒瓶中，按酶解提取最佳條件提取，然后在微波功率600 W，控制微波溫度60℃條件下提取2次，每次15 min，3次試驗(yàn)刺玫葉總黃酮提取率分別為31.87、32.64、32.12mg·g-1，平均為32.21mg·g-1，結(jié)果表明微波協(xié)同后刺玫葉總黃酮提取率比酶法提高2.08mg·g-1。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)法對(duì)微波協(xié)同酶法提取刺玫葉總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。其最佳工藝條件為：提取溶劑為75%乙醇、料液比1∶25、復(fù)合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間120min、酶解提取2次、酶解體系pH4.5、微波功率600W，微波處理時(shí)間15min、微波溫度60℃、微波提取2次，在此工藝條件下，刺玫葉總黃酮提取率為32.21mg·g-1。

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