瀘定百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與特性分析

姜福星，楊麗娟，陳其兵，高 順

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林研究所，四川 成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)林業(yè)研究所，四川 成都611130）

瀘定百合（Lilium sargenttiae），又名通江百合，是百合科百合屬（Liliumspp.）多年生草本植物，主要產(chǎn)于云南、貴州、四川和廣西等地，不但植株高大、花型優(yōu)美、花朵潔白芳香，而且對(duì)鐮刀菌枯萎病等病害和高溫干旱的抗性均較強(qiáng)，生態(tài)適應(yīng)性好，作為含有優(yōu)良基因的寶貴的種質(zhì)資源，是進(jìn)行百合育種的理想材料［1-10］。鱗莖作為百合屬植物的一種地下變態(tài)莖，不但是營(yíng)養(yǎng)貯藏器官，具有較高的食用和藥用價(jià)值，而且可以作為繁殖的重要材料；可見(jiàn)百合的鱗莖具有營(yíng)養(yǎng)和繁殖的雙重作用，作為互相轉(zhuǎn)化的“源和庫(kù)”，對(duì)于百合的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)于科研和生產(chǎn)均具有重要的價(jià)值和意義，引起了廣泛的關(guān)注并成為研究的熱點(diǎn)［11-17］。

對(duì)于地下變態(tài)器官的研究，馬鈴薯（Solanum tuberosum）的 塊 莖 和 蓮 藕 （Nelumbo nucifera Gaertn）的根狀莖等地下變態(tài)器官的分子機(jī)理的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展［18-19］。對(duì)于百合屬植物鱗莖的研究，目前主要停留在鱗莖的發(fā)育和活性成分兩個(gè)方面：第一，在鱗莖的發(fā)育方面，對(duì)蘭州百合（L.davidii var.unicolor）、毛百合（L.dauricum）、鐵炮百合（L.longiflorum）等野生種及亞洲百合和東方百合的少數(shù)栽培品種中，從發(fā)育過(guò)程、激素的影響、培養(yǎng)方式、可溶性糖、蛋白質(zhì)和淀粉酶的變化等方面進(jìn)行了相關(guān)研究［20-23］；其次，在藥用活性成分方面，對(duì)卷丹（L.lancifolium）、宜昌百合（L.leucanthum）和蘭州百合等百合科植物的藥用活性成分進(jìn)行了提取和測(cè)定等方面的研究［24-29］；但是百合屬植物鱗莖的分子生物學(xué)方面的研究卻未見(jiàn)報(bào)道，基因信息和功能基因的分析嚴(yán)重缺乏，成為制約后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)的瓶頸，是未來(lái)研究的重要方向［11-13］。對(duì)于瀘定百合，雖然已經(jīng)進(jìn)行了組織培養(yǎng)、生態(tài)適應(yīng)性、細(xì)胞遺傳、分子標(biāo)記和抗病機(jī)理等方面的研究［4-10］，但在鱗莖發(fā)育及次生代謝的分子機(jī)理等方面更是嚴(yán)重空白，需要分子數(shù)據(jù)支撐。

新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展對(duì)于分子生物學(xué)的研究起到了巨大的推動(dòng)作用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Transcriptome sequencing）是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，是基于特定的測(cè)序平臺(tái)，研究特定組織或細(xì)胞在某個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA，獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，進(jìn)而得到的基因功能注釋、蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列、基因的表達(dá)量、代謝途徑等大量信息，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和重要參考［30］。不僅能夠廣泛應(yīng)用于有參考基因組序列的物種研究，如水稻、葡萄等，也能應(yīng)用于無(wú)參考基因組序列的物種，如樟樹(shù)、丹參、蠟梅、白木香、虎杖、鳥(niǎo)巢蕨、花椒等，應(yīng)用較為廣泛［30-38］。

鑒于此，本研究以瀘定百合的鱗莖為材料，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，從分子水平上研討瀘定百合鱗莖發(fā)育過(guò)程中重要基因的表達(dá)與作用，以及生理生化及次生代謝的分子機(jī)制，為功能基因的挖掘奠定基礎(chǔ)，為也為百合屬植物基因工程育種提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所采用的材料采集于四川省甘孜自治州瀘定縣瀘定鎮(zhèn)，經(jīng)姜福星和祝波等鑒定為瀘定百合（Lilium sargenttiae），盆栽于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的苗圃內(nèi)，作為試驗(yàn)材料備用。

1.2 RNA提取

從盆栽的2株2a瀘定百合，選取其鱗莖，用自來(lái)水沖洗干凈，參照文獻(xiàn)中的方法［30-38］，使用TRIzol試劑（Invitrogen美國(guó)）分別提取總RNA，為清除殘留的基因組DNA，每個(gè)RNA樣本中加入10U DNaseI（Takara，日本）37℃孵育30min，測(cè)定RNA樣本的濃度后，每個(gè)樣本各取10μg等量混合組成一個(gè)RNA池（RNA pool，共20μg）。接著使用Oligotex mRNAMidi Kit（Qiagen，德國(guó)）分離純化樣品mRNA。整個(gè)RNA的質(zhì)量和含量通過(guò)使用Nanodrop ND-1000（LabTech，美國(guó)）檢測(cè)吸光度260nm／280nm（A260／A280）進(jìn)行測(cè)定，RNA 的完整性通過(guò)1.5%（w／v）凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 cDNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建及Illumina HiSeq TM2000高通量測(cè)序

參照文獻(xiàn)中的方法［31-39］，使用 SOLiD Whole Transcriptome Analysis Kit（Life technologies，美國(guó)），參照其說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建隨機(jī)片段測(cè)序文庫(kù)。用帶有 Oligo（dT）的磁珠富集poly（A）mRNA，加入打斷試劑在恒溫振蕩孵育器中適溫將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；利用DNA polymerase I，dNTPs及RNaseH配制第二鏈合成反應(yīng)體系合成第二鏈cDNA；經(jīng)過(guò)試劑盒純化回收、黏性末端修復(fù)后，在cDNA的3，末端加上堿基“A”并連接接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到測(cè)序文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)過(guò)質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列拼接與組裝

參照文獻(xiàn)中的方法［30-38］，使用二代測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)軟件Trimmomatic（v0.30）對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)去除接頭以及低質(zhì)量序列等，得到后續(xù)信息分析的有效數(shù)據(jù)，采用軟件FastQC（v0.10.1）進(jìn)行分析，評(píng)估結(jié)果信息；對(duì)用短reads組裝軟件Trinity進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組樣品數(shù)據(jù)從頭組裝，對(duì)組裝結(jié)果通過(guò)序列聚類(lèi)軟件cd-hit-est（v4.5.4）做進(jìn)一步序列拼接和去冗余處理，得到長(zhǎng)的非冗余的Unigene序列，采用短reads組裝軟件trinity（版本號(hào)r2013-02-25）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組樣品數(shù)據(jù)從頭組裝，對(duì)組裝結(jié)果通過(guò)序列聚類(lèi)軟件cd-hit-est（v4.5.4）做進(jìn)一步序列拼接和去冗余處理，得到長(zhǎng)的非冗余的Unigene序列

1.5 Unigene功能注釋、分類(lèi)和代謝路徑分析

參照文獻(xiàn)中的方法［30-38］，用Blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)NR（NCBI非冗余蛋白庫(kù)）、GO（國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類(lèi)體系，使用blast2GO軟件進(jìn)行基因GO功能分析）、KEGG（系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)）和COG（對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類(lèi)的數(shù)據(jù)庫(kù)）（E值＜1e-5），再通過(guò)BlastN將Unigene比對(duì)到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)NR（NCBI非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)）（E值＜1e-5），得到給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。采用Blast2GO軟件，根據(jù)NR注釋信息得到GO注釋信息；采用WEGO軟件對(duì)ALLUnigene（按照分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程）進(jìn)行GO功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)瀘定百合鱗莖的基因功能分布特征。將Unigene序列按NR、GO、KEGG和COG的順序做BlastX比對(duì)（E值＜1e-5）。取比對(duì)結(jié)果中Rank最高的蛋白確定該Unigene的編碼序列，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)密碼子表將該編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列，從而得到該Unigene的核酸序列（序列方向5′→3′）和氨基酸序列。根據(jù)NR注釋結(jié)果，使用blast2G0軟件進(jìn)行基因本體GO功能分析，得到每個(gè)基因的GO信息以及GO功能分類(lèi)，在宏觀水平上了解該物種或者樣品的基因功能分布特征。根據(jù)KEGG注釋的基因功能信息，對(duì)參與次生代謝的序列（按次生代謝物種類(lèi)）進(jìn)行分類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA測(cè)序及序列拼接組裝

采用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)2年生瀘定百合鱗莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)及去除雜質(zhì)后的有效數(shù)據(jù)結(jié)果列于表1。獲得Unigene有43 412個(gè)，最長(zhǎng)超過(guò)2 000bp，（圖1）。

2.2 序列功能注釋

基于序列相似性搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息對(duì)未知功能的序列進(jìn)行注釋。將所有Unigene與核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（NR，GO，COG，KEGG）進(jìn)行BLAST程序搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)，43 412個(gè)Unigene中，30 225條Unigene得到56 829個(gè)NR功能注釋?zhuān)?9.62%；有21 531條 Unigene得到96 755個(gè) GO注釋?zhuān)?9.60%；14 069條 Unigene得到COG功能注釋?zhuān)?2.41%；10 822條 Unigene參與了KEGG代謝途徑，占24.93%；被注釋的Unigene中，得到NR功能注釋最多，但也有30.38%尚未得到注釋?zhuān)浯问荊O功能注釋?zhuān)俅问荂OG功能注釋?zhuān)琄EGG最少，有可能是未知功能的新基因（表1）?；蚬δ茏⑨尩慕Y(jié)果表明，現(xiàn)有生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分子生物學(xué)研究對(duì)瀘定百合及百合屬植物的基因或轉(zhuǎn)錄組信息是很有限的，有待深入挖掘。

表1 注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Summary of annotation results

2.3 Unigene的GO分類(lèi)

根據(jù)GO注釋?zhuān)谒修D(zhuǎn)錄物中，注釋歸為細(xì)胞組分的有54 070個(gè)（40%），歸為分子功能的有22 950個(gè) （17%），歸為生物過(guò)程的有 57 911 個(gè)（43%）。上述3大類(lèi)可被劃分為更加詳細(xì)的52個(gè)類(lèi)別，分別包含17、13和22個(gè)功能亞類(lèi)。在細(xì)胞組分功能類(lèi)型中，主要有細(xì)胞和細(xì)胞部分等；在分子功能類(lèi)型中，主要有蛋白結(jié)合和催化活性等；在生物學(xué)過(guò)程類(lèi)型中，主要的生命過(guò)程分別是代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程、生長(zhǎng)及免疫系統(tǒng)過(guò)程等（圖2）。并從其分子功能分類(lèi)中發(fā)現(xiàn)有374條Unigene，為能結(jié)合到DNA上的轉(zhuǎn)錄因子，包括與器官發(fā)育密切相關(guān)的ARF（生長(zhǎng)素響應(yīng)因子）、PPR 蛋白、BTB／POZ、ERF、MADS-box等轉(zhuǎn)錄因子［31-34］，可能在瀘定百合鱗莖的形成和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有待于深入研究。

2.4 Unigene的COG分類(lèi)

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄組的完整性和注釋的有效性，對(duì)Unigene進(jìn)行了COG分類(lèi)，共獲得14 069個(gè)COG功能注釋?zhuān)婕?4個(gè)COG功能類(lèi)別，其中，“一般功能基因”（general function prediction only）的轉(zhuǎn)錄物最多，有2 464個(gè)，占17.51%；其次為“蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)及分子伴侶相關(guān)基因”（posttranslational modification，protein turnover and chaperones），比例為9.48%。在該轉(zhuǎn)錄組中，涉及植株生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的功能定義主要包括：RNA組裝修飾、染色體結(jié)構(gòu)變化、能量生產(chǎn)轉(zhuǎn)化、氨基酸運(yùn)輸代謝、核酸運(yùn)輸代謝、糖類(lèi)運(yùn)輸代謝、輔酶運(yùn)輸代謝、脂類(lèi)運(yùn)輸代謝、細(xì)胞循環(huán)控制與細(xì)胞分裂及染色體參與、翻譯與核糖體結(jié)構(gòu)及合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)錄等多個(gè)生理生化過(guò)程（圖3，表2）。

2.5 KEGG分析

采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)瀘定百合可能參與的生理生化反應(yīng)途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)。分析結(jié)果表明，10 822個(gè)得到注釋的基因中有1 279個(gè)基因參與新陳代謝的反應(yīng)，其中的571個(gè)基因參加了次生代謝途徑（表2）。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，次生代謝物途徑主要包括：黃酮和類(lèi)黃酮（Flavone and flavonol biosynthesis）4個(gè)、倍半萜化合物和三萜皂苷（Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）3 個(gè)、玉 米 素（Zeatin biosynthesis）5個(gè)、二萜類(lèi)（Diterpenoid biosynthesis）6個(gè)、異喹啉類(lèi)生物堿（Isoquinoline alkaloid biosynthesis）10個(gè)、莨菪烷、哌啶和吡啶（Tropane，piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）13個(gè)、類(lèi)胡蘿卜素（Carotenoid biosynthesis）18個(gè)、類(lèi)甾醇（Steroid biosynthesis）20個(gè)、芪類(lèi)化合物、二芳基庚和姜辣素（Stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis）18個(gè)、硒復(fù)合物代謝途徑（Selenocompound metabolism）14個(gè)、甜菜紅色素（Betalain）1個(gè)（表2）；豐富多彩的次生代謝途徑實(shí)際上就是一個(gè)個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，KEGG代謝途徑中硒元素結(jié)合蛋白及其相關(guān)的甲酸脫氫酶、催淚因子合酶、查爾酮合酶、鋅離子結(jié)合蛋白和花姜酮等較高的藥用活性物質(zhì)的重要功能基因，就是構(gòu)成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。此外，還包括：?；撬崤c亞?；撬岽x途徑（Taurine and hypotaurine metabolism）8個(gè)，亞油酸（Linoleic acid）7個(gè)，賴氨酸（Lysine）13個(gè)，葉酸（Folate）17個(gè)，不飽和脂肪酸（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）17個(gè)等營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值很高的生理生化途徑（表3）。這為瀘定百合的鱗莖具有較高的藥用保健價(jià)值提供了分子水平的證據(jù)，暗示其在營(yíng)養(yǎng)保健、醫(yī)藥化工等領(lǐng)域有廣泛的研究開(kāi)發(fā)前景。

2.6 次生代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶

倍半萜（烯）化合物和三萜皂苷是瀘定百合主要藥用成分之一，其生物合成涉及到鯊烯合酶、法呢酰二磷酸酯法呢酰基轉(zhuǎn)移酶、金合歡醇脫氫酶三種關(guān)鍵酶，每一種酶均有1條Unigene參加（表3）；芪類(lèi)化合物、二芳基庚烷和姜辣素也是瀘定百合的重要藥用活性成分，通過(guò)同源性搜索，找到15條Unigene可能編碼該代謝途徑的4個(gè)關(guān)鍵酶，包括肉桂酸-4-羥化酶（CYP73A）5個(gè)，咖啡酰CoA甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）4條，莽草酸酯（HCT）2條，羥基肉桂酸基轉(zhuǎn)移酶（CYP98A3）3條，其他1條Unigene參與了一種功能有待于確定的合成酶的作用（表4）。

圖1 Unigene長(zhǎng)度分布Fig.1 Pie chart for different lengths of Unigene

圖2 Unigene GO功能分類(lèi)Fig.2 Unigenes functional classification

圖3 Unigene COG功能分類(lèi)Fig.3 COG function classification of all Unigene

表2 COG功能分類(lèi)及數(shù)量Table 2 COG function classification and their number

表3 主要的KEGG代謝途徑Table 3 Important KEGG pathway categories in secondary metabolites

表4 瀘定百合KEGG代謝途徑中倍半萜和三萜皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶Table 4 The annotation results of KEGG pathways for sequiterpenoid and triterpenoid biosynthesis in L.sargentiae

表5 瀘定百合的KEGG代謝途徑中芪類(lèi)化合物、二芳基庚酸類(lèi)和姜辣素的關(guān)鍵酶Table 5 The annotation results of KEGG pathways for stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis in L.sargentiae

3 結(jié)論與討論

本研究首次采用高通量測(cè)序技術(shù)首次對(duì)瀘定百合鱗莖進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，獲得大量與瀘定百合鱗莖生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的分子數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)軟件共拼接得到43 412條Unigene，其中發(fā)現(xiàn)有30 225條和21 531條Unigene分別獲得NR和GO注釋?zhuān)?4 069條Unigene得到COG注釋?zhuān)珿O注釋中獲得374條Unigene可能作為轉(zhuǎn)錄因子參與瀘定百合鱗莖的形成與發(fā)育，包括與器官發(fā)育密切相關(guān)的ARF（生長(zhǎng)素響應(yīng)因子）、PPR 蛋白、BTB／POZ、ERF、MADS-box等轉(zhuǎn)錄因子［39-41］，可能在瀘定百合鱗莖形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為探討瀘定百合鱗莖的形成與發(fā)育的分子機(jī)制，提供了重要線索，有待于深入展開(kāi)研究。

同時(shí)，也獲得了瀘定百合鱗莖生理生化及次生代謝相關(guān)的有效信息，分析表明，共有10 822條Unigene參與了KEGG代謝途徑；1 279條Unigene參與了新陳代謝途徑，其中571條Unigene參與了次生代謝途徑。藥用活性物質(zhì)代謝途徑主要包括：?jiǎn)屋?、雙萜、倍半萜和三萜皂苷、萜類(lèi)骨架等萜類(lèi)合成途徑的Unigene 5條，細(xì)胞色素P450的Unigene 74條，苯丙烷代謝途徑的Unigene 48條，黃酮和黃酮醇Unigene 4條，四環(huán)素的Unigene 6條，單萜的Unigene 3條，甜菜素的 Unigene 1條，咖啡因的Unigene 3條，新生霉素的 Unigene 3條，玉米素的Unigene 5條，油菜素甾醇途徑的 Unigene 4條等。還發(fā)現(xiàn)了一些具有很高營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值和生理活性的生化途徑，包括聚酮合酶、賴氨酸合成途徑、多聚糖途徑、膽甾醇丁酸酯途徑、類(lèi)甾醇途徑、葉酸、核黃素、?；撬岷蛠喤；撬岬取Ｉ鲜鰹o定百合鱗莖的生理生化途徑是在百合科植物中首次報(bào)道，從分子水平證明了瀘定百合含有很多的藥用活性物質(zhì)，在醫(yī)藥化工、營(yíng)養(yǎng)保健等領(lǐng)域具有很大的開(kāi)發(fā)研究潛力。

本研究對(duì)瀘定百合鱗莖進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組及其特性分析，提供了大量參與瀘定百合鱗莖形成發(fā)育相關(guān)的基因信息，包括器官發(fā)育、抗病抗逆、生理生化、次生代謝等，特別是調(diào)控鱗莖發(fā)育和次生代謝過(guò)程中的重要功能基因，為開(kāi)展瀘定百合鱗莖形成和發(fā)育的分子機(jī)制、藥用活性成分等方面的研究，進(jìn)而進(jìn)行百合的分子育種和研究開(kāi)發(fā)，提供了參考和依據(jù)。

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